【正文】 ，酵母的丙酮酸羧化酶在沒(méi)有乙酰輔酶A存在時(shí)也有活性。這種特殊的現(xiàn)象依賴于K+或者其它單價(jià)陽(yáng)離子的存在[91]。酵母的丙酮酸羧化酶在乙酰輔酶A濃度飽和時(shí)的活性比沒(méi)有乙酰輔酶A的時(shí)候要高3～4倍。這是因?yàn)?，乙酰輔酶A的濃度高時(shí)，它進(jìn)入TCA循環(huán)徹底氧化需要結(jié)合大量的草酰乙酸。作為草酰乙酸回補(bǔ)途徑中最主要的催化酶，其活性就會(huì)提高。除了乙酰輔酶A之外，長(zhǎng)鏈脂肪酸?；o酶A也會(huì)激活丙酮酸羧化酶。天冬氨酸是丙酮酸羧化酶的非競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，而它的催化產(chǎn)物草酰乙酸則是一種競(jìng)爭(zhēng)抑制劑[92]。雖然丙酮酸羧化酶的活性受到很多底物的調(diào)節(jié)，但由于它是一種組成酶。有氧條件下，在一系列不同底物上培養(yǎng)釀酒酵母，其丙酮酸羧化酶的活性之差不會(huì)超過(guò)兩倍[93]。與有氧條件相比較，在無(wú)氧條件下，相同的培養(yǎng)基成分上培養(yǎng)時(shí)，其丙酮酸羧化酶的活性之差要大于兩倍或者更多。向培養(yǎng)基中添加天冬氨酸，其丙酮酸羧化酶的活性會(huì)下降50%。盡管如此，在含有天冬氨酸的培養(yǎng)基中，二氧化碳的固定作用仍然會(huì)進(jìn)行[94]。在釀酒酵母中，含有兩個(gè)編碼丙酮酸羧化酶的結(jié)構(gòu)基因：pyc1和pyc2。他們都能編碼一個(gè)能結(jié)合生物素而被激活的酶蛋白。兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平都因酵母的生長(zhǎng)時(shí)期不同而不同。特別的是，pyc1的轉(zhuǎn)錄水平在以乙醇為碳源的培養(yǎng)基上要比以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上要高[95]。 調(diào)節(jié)丙酮酸代謝節(jié)點(diǎn)上的代謝流量代謝網(wǎng)絡(luò)中的任何反應(yīng)都可以從三個(gè)方面進(jìn)行控制：①相關(guān)的酶合成；②這些酶的共價(jià)修飾；③細(xì)胞內(nèi)底物和效應(yīng)物的濃度。原則上，這三個(gè)機(jī)制都會(huì)影響釀酒酵母中的丙酮酸的代謝。不過(guò)，人們理所當(dāng)然地對(duì)代謝節(jié)點(diǎn)上的底物濃度對(duì)代謝的影響給予了更多的關(guān)注。Holzer[96]最先指出細(xì)胞內(nèi)的丙酮酸濃度可能是調(diào)節(jié)釀酒酵母發(fā)酵和有氧呼吸的一個(gè)重要參數(shù)。后來(lái)，其他科學(xué)家觀察發(fā)現(xiàn)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的Km值跟丙酮酸脫羧酶的Km值相比要小一個(gè)數(shù)量級(jí)[97]。由此可以推出，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的丙酮酸處于很低濃度的時(shí)候，丙酮酸的進(jìn)一步代謝是由丙酮酸脫氫酶復(fù)合體催化的呼吸異化作用，而丙酮酸脫羧酶催化的反應(yīng)只能看作為一個(gè)旁路。相反，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)丙酮酸濃度很高的時(shí)候，丙酮酸的異化作用就主要是由丙酮酸脫羧酶催化進(jìn)行，從而產(chǎn)生大量的乙醇。這就是在有氧條件下，當(dāng)葡萄糖濃度很高的時(shí)候，引起細(xì)胞內(nèi)丙酮酸濃度增加，從而使代謝流向丙酮酸脫羧酶生成乙醇，這就是我們熟知的Crabtree效應(yīng)[66]。在討論不同的酶對(duì)同一種底物的競(jìng)爭(zhēng)作用時(shí)，需要考慮到，酶和底物之間的親和力不能只由Km值來(lái)衡量。從米氏方程可以知道，當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，反應(yīng)速率與底物濃度之間近似為一個(gè)一階方程。在底物濃度很低的條件下，由于細(xì)胞內(nèi)的酶的濃度也會(huì)影響到反應(yīng)速率，親和力應(yīng)該等于Vmax/Km而不是1/Km。在釀酒酵母中，即使是在限制葡萄糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行有氧呼吸時(shí)，丙酮酸脫羧酶的濃度還是很高的[98]。所以可以推測(cè)出高濃度的丙酮酸脫羧酶可以彌補(bǔ)它的高Km值，從而能與線粒體中的丙酮酸脫氫酶去競(jìng)爭(zhēng)代謝丙酮酸。盡管如此，在有氧條件下，限制葡萄糖濃度的恒化器上培養(yǎng)釀酒酵母時(shí)，丙酮酸脫氫酶復(fù)合體催化的異化作用占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。但是不管丙酮酸脫氫酶對(duì)丙酮酸的競(jìng)爭(zhēng)的優(yōu)勢(shì)有多大，也不可能完全阻止有丙酮酸由丙酮酸脫羧酶進(jìn)行催化。因?yàn)楸崦擊让复呋姆磻?yīng)為細(xì)胞質(zhì)提供給了必需的乙酰輔酶A，盡管目前對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的乙酰輔酶A到底是怎樣由丙酮酸脫羧酶催化生成的。參與釀酒酵母丙酮酸代謝的另外一個(gè)酶，丙酮酸羧化酶，由于它是以一種組成型的酶，它的酶活只受底物和效應(yīng)物的調(diào)節(jié)而不是酶合成的調(diào)節(jié)。要想增加丙酮酸羧化酶催化形成的產(chǎn)物草酰乙酸合成，就要先通過(guò)增加細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)的丙酮酸濃度。如果提高了細(xì)胞內(nèi)的丙酮酸濃度，就必然會(huì)增加代謝流向丙酮酸脫羧酶。因此，對(duì)草酰乙酸需求的增加是增加代謝流向丙酮酸脫羧酶的一個(gè)直接原因。這可能就是在有氧條件下，當(dāng)細(xì)胞快速生長(zhǎng)時(shí)由呼吸作用轉(zhuǎn)向呼吸和發(fā)酵作用共存的原因。丙酮酸通過(guò)丙酮酸脫羧酶異化并不就等同于酒精發(fā)酵，因?yàn)樾纬傻囊胰┮部梢赃M(jìn)入有氧呼吸。而且異化乙醛的關(guān)鍵酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)似乎更傾向于呼吸異化，因?yàn)?，催化乙醛的乙醛脫氫酶的Km值比乙醇脫氫酶的Km值要低兩個(gè)數(shù)量級(jí)[99]。無(wú)論是在丙酮酸代謝節(jié)點(diǎn)上還是在乙醛的代謝節(jié)點(diǎn)上，都不只是酶對(duì)底物的親和力決定其代謝的命運(yùn)，調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶合成的輔因子和效應(yīng)物也對(duì)其代謝有很大的影響。比如在限制葡萄糖濃度培養(yǎng)基上培養(yǎng)酵母時(shí)，其代謝由呼吸轉(zhuǎn)向發(fā)酵在一定程度上就要受到乙醛脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶這兩種酶的合成的影響[98]。由此我們可以歸納得出，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)丙酮酸濃度很高的時(shí)候，丙酮酸更傾向于被丙酮酸脫羧酶催化分解，而使得丙酮酸脫氫酶復(fù)合體催化的反應(yīng)所占的比例很少。有丙酮酸脫羧酶催化的丙酮酸異化作用最終會(huì)流向酒精發(fā)酵。而丙酮酸羧化酶在丙酮酸的亦異化作用中也起到很大的作用。這就為如何調(diào)節(jié)丙酮酸流向丙酮酸脫羧酶，減少其流向丙酮酸脫氫酶復(fù)合體提供了依據(jù)。 釀酒酵母生產(chǎn)丙酮酸可行性分析，利用釀酒酵母來(lái)生產(chǎn)丙酮酸具有較好的優(yōu)勢(shì)：①釀酒酵母在厭氧條件或溢出代謝條件下，糖酵解代謝流旺盛，乙醇支路代謝流比例極高，若能夠有效將乙醇產(chǎn)出轉(zhuǎn)化為丙酮酸積累，可以期望達(dá)到較高的丙酮酸產(chǎn)量；②釀酒酵母可代謝底物廣泛，而且釀酒酵母的大規(guī)模發(fā)酵和技術(shù)生產(chǎn)過(guò)程相對(duì)成熟；③釀酒酵母遺傳背景相對(duì)清晰，遺傳分子操作可行性高；④釀酒酵母自身的環(huán)境耐受性強(qiáng)，它可以耐受較低的pH條件及較高的糖類濃度，而且它對(duì)生物質(zhì)水解產(chǎn)物中的一些抑制因子具有較高的抵抗性，生長(zhǎng)活力高。因此利用釀酒酵母來(lái)達(dá)到積累丙酮酸的目的可期望值較高。⑤釀酒酵母葡萄糖和丙酮酸的代謝都比較清楚，可以清楚地知道如何去控制代謝，加速葡萄糖到丙酮酸的代謝速度，從而又快又好地積累高濃度的丙酮酸。 基因敲除基因敲除(gene knockout)是通過(guò)外源DNA與染色體DNA之間的同源重組技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，具有位點(diǎn)專一性強(qiáng)、打靶后目的片段可以與染色體DNA共同穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)，目前己成為一種較理想的改造生物遺傳物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法。基因敲除技術(shù)早在20世紀(jì)70年代就在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中得以應(yīng)用[100]。80年代初，胚胎干細(xì)胞((ES細(xì)胞)分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。1985年，首次證實(shí)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源重組的存在，奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型。此后的幾年中，基因敲除技術(shù)得到了進(jìn)一步的發(fā)展和完善[101]?；蚯贸夹g(shù)在研究基因功能中發(fā)揮了巨大的作用。在釀酒酵母基因功能研究過(guò)程中基因敲除技術(shù)不斷的被改進(jìn)，得到訊速的發(fā)展?；蚯贸夹g(shù)主要是將構(gòu)建好的基因敲除序列組件轉(zhuǎn)化至細(xì)胞后由同源重組實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的敲除。其中的基因敲除序列組件是在選擇標(biāo)記基因的兩側(cè)分別連接一段與目標(biāo)基因兩側(cè)同源的短片段構(gòu)成。同源重組的效率在很大程度上依賴于基因敲除組件提供的同源區(qū)域兩側(cè)的片斷長(zhǎng)度[102]。不同物種發(fā)生同源重組所需的同源序列的長(zhǎng)度也有所不同，如表12所示。在釀酒酵母同源重組實(shí)驗(yàn)中用過(guò)的最小的同源片斷為35個(gè)堿基對(duì)[103]。一般使用的同源序列的長(zhǎng)度為30～45個(gè)堿基對(duì)。對(duì)于一些基因要求60～90個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的同源片段才能有效的介導(dǎo)同源重組。表12同源重組所需的序列的長(zhǎng)度Table12 Length of homologous sequence needed for homologous rebinationSpeciesLength of homologous sequence(bp)Saccharomyces cerevisiae35～40Schizosaccharomyces pombe60～80Kluyveromyces lactis51～55Ashbya gossypii45Candida albicans60～100Escherichia coli42Streptomyces coelicolor39 本課題立題依據(jù)及研究?jī)?nèi)容. 立題依據(jù)近年來(lái)對(duì)丙酮酸及丙酮酸系列產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用正日益深入，商業(yè)上的需求也持續(xù)增長(zhǎng)。目前我國(guó)有約10家企業(yè)生產(chǎn)丙酮酸，他們大部分采用落后的酒石酸合成法，總產(chǎn)量約1000噸/年。丙酮酸是一種酮酸，性質(zhì)活潑，化工生產(chǎn)成本高，傳統(tǒng)的酒石酸法制取成本約8萬(wàn)元，由復(fù)旦大學(xué)最新開(kāi)發(fā)的乳酸乙酯空氣氧化法成本也在約5萬(wàn)元左右。丙酮酸市場(chǎng)價(jià)格約8～9萬(wàn)元/噸，而化學(xué)法的高成本造成生產(chǎn)企業(yè)無(wú)利可圖，嚴(yán)重限制了相關(guān)行業(yè)的發(fā)展。因此開(kāi)展發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的研究就現(xiàn)得尤其重要，它可促進(jìn)有關(guān)行業(yè)的快速發(fā)展，減少對(duì)國(guó)外產(chǎn)品的依賴。生物發(fā)酵法具有原料來(lái)源廣泛，能耗低、污染少、成本低等特點(diǎn)，近年來(lái)人們開(kāi)始把目光聚焦到發(fā)酵法的研究上來(lái)。日本學(xué)者經(jīng)過(guò)半個(gè)世紀(jì)的研究發(fā)現(xiàn)一種酵母菌能大量積累丙酮酸，他們根據(jù)代謝調(diào)控理論經(jīng)過(guò)進(jìn)一步誘變，選育出一系列的丙酮酸高產(chǎn)菌株，%，日本已于1989年實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的工業(yè)化。近年來(lái)我國(guó)學(xué)者也開(kāi)始研究發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸，但丙酮酸發(fā)酵濃度一直沒(méi)有跨越80g/L。根據(jù)同為代謝中間代謝產(chǎn)物的乳酸和檸檬酸的最高發(fā)酵水平可達(dá)200g/L這一事實(shí)，丙酮酸理應(yīng)在發(fā)酵液中積累更高數(shù)量。釀酒酵母耐性較強(qiáng)，可以減少中發(fā)酵過(guò)程中中和劑的添加，使丙酮酸的分離提取更簡(jiǎn)單。而且釀酒酵母葡萄糖到丙酮酸代謝速度快，再加上釀酒酵母葡萄糖代謝與丙酮酸代謝的特點(diǎn)可以推測(cè)，通過(guò)使丙酮酸脫羧酶缺失，有望得到一株丙酮酸高產(chǎn)菌株。（1）以釀酒酵母Y2為出發(fā)菌株，質(zhì)粒TP1K經(jīng)NotⅠ 酶切后，回收pdc1基因敲除片段P1K，把P1K轉(zhuǎn)入Y2中，經(jīng)篩選驗(yàn)證得到pdc1基因敲除菌株Y21△。（2）以釀酒酵母Y21△為出發(fā)菌株，質(zhì)粒TP5H經(jīng)NotⅠ 酶切后，回收pdc5基因敲除片段P5H，把P5H轉(zhuǎn)入Y21△中，經(jīng)篩選驗(yàn)證得到pdc1與pdc5基因同時(shí)敲除的菌株Y21△5△。（3）測(cè)定YY21△、Y21△5△的丙酮酸脫羧酶的活性，比較敲除基因之后酶活的變化。（4）用southern blot 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因敲除菌株。（5）優(yōu)化Y21△5△發(fā)酵產(chǎn)丙酮酸的種子培養(yǎng)基。（6）優(yōu)化Y21△5△發(fā)酵產(chǎn)丙酮酸的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。17天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文2 材料與方法 實(shí)驗(yàn)材料 菌種和質(zhì)粒（1）釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y2單倍體（Mata，his，leu，thr），實(shí)驗(yàn)室保存。（2）質(zhì)粒TP1K，含有pdc1基因敲除片段P1K；質(zhì)粒TP5H，含有pdc5基因敲除片段P5H。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建 主要試劑 工具酶、分子量Marker和試劑盒 限制性內(nèi)切酶NotⅠ、BamHⅠ購(gòu)于Fermentas公司，Taq酶購(gòu)于天根生化科技公司。 1kb DNA Marker和DNA MarkerⅢ，購(gòu)于天根生化科技公司。 1kb DNA Marker 購(gòu)于TaKaRa Biotechnology公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于上海捷瑞生物工程有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司。酵母基因組提取試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司。DIG DNA標(biāo)記試劑盒購(gòu)于深圳萊伯克生物科技有限公司。DIG 雜交檢測(cè)試劑盒購(gòu)于深圳萊伯克生物科技有限公司。EDTA 分析純天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠丙三醇分析純天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠異戊醇分析純天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠瓊脂粉生物級(jí)北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司無(wú)水乙醇分析純天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠氯仿分析純天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠冰乙酸分析純天津市北方化玻采購(gòu)銷售中心Tris超純級(jí)北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司十二烷基磺酸鈉超純級(jí)北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司山梨醇生物級(jí)北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司瓊脂糖電泳級(jí)OXOID 公司Tris飽和酚生化級(jí)北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司胰蛋白胨生化級(jí)OXOID 公司酵母提取物生化級(jí)OXOID 公司鮭魚(yú)精DNA分析純Sigma公司G418分析純Sigma公司PEG3350分析純Sigma公司醋酸鋰分析純天津科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心二硫蘇糖醇分析純北京seaskybio 公司考馬斯亮藍(lán)G250分析純寶生物牛血清蛋白分析純寶生物βNADH分析純Sigma公司硫酸分析純天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠亮氨酸分析純天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所蘇氨酸分析純天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所YNB分析純Sigma公司 主要儀器和設(shè)備儀器名稱生產(chǎn)廠家752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)天津市華偉科技發(fā)展有限公司電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫(yī)療儀器廠YP1200電子天平上海精科天平BS124S分析天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司HYG搖床上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司DELTA320 pH計(jì)梅特勒托利多儀器（上海）有限公司電熱鼓風(fēng)干燥箱天津天宇機(jī)電有限公司TGL16G臺(tái)式高速離心機(jī)上海醫(yī)用分析儀器廠XW80A旋渦混合儀海門市其林貝爾儀器制造有限公司移液器芬蘭BIOHIT公司電泳儀美國(guó)BIORAD公司電泳槽美國(guó)BIORAD公司Biometra 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