【正文】 ，酵母的丙酮酸羧化酶在沒有乙酰輔酶A存在時也有活性。這種特殊的現(xiàn)象依賴于K+或者其它單價陽離子的存在[91]。酵母的丙酮酸羧化酶在乙酰輔酶A濃度飽和時的活性比沒有乙酰輔酶A的時候要高3～4倍。這是因為，乙酰輔酶A的濃度高時，它進(jìn)入TCA循環(huán)徹底氧化需要結(jié)合大量的草酰乙酸。作為草酰乙酸回補(bǔ)途徑中最主要的催化酶，其活性就會提高。除了乙酰輔酶A之外，長鏈脂肪酸?；o酶A也會激活丙酮酸羧化酶。天冬氨酸是丙酮酸羧化酶的非競爭抑制劑，而它的催化產(chǎn)物草酰乙酸則是一種競爭抑制劑[92]。雖然丙酮酸羧化酶的活性受到很多底物的調(diào)節(jié)，但由于它是一種組成酶。有氧條件下，在一系列不同底物上培養(yǎng)釀酒酵母，其丙酮酸羧化酶的活性之差不會超過兩倍[93]。與有氧條件相比較，在無氧條件下，相同的培養(yǎng)基成分上培養(yǎng)時，其丙酮酸羧化酶的活性之差要大于兩倍或者更多。向培養(yǎng)基中添加天冬氨酸，其丙酮酸羧化酶的活性會下降50%。盡管如此，在含有天冬氨酸的培養(yǎng)基中，二氧化碳的固定作用仍然會進(jìn)行[94]。在釀酒酵母中，含有兩個編碼丙酮酸羧化酶的結(jié)構(gòu)基因：pyc1和pyc2。他們都能編碼一個能結(jié)合生物素而被激活的酶蛋白。兩個基因的轉(zhuǎn)錄水平都因酵母的生長時期不同而不同。特別的是，pyc1的轉(zhuǎn)錄水平在以乙醇為碳源的培養(yǎng)基上要比以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上要高[95]。 調(diào)節(jié)丙酮酸代謝節(jié)點上的代謝流量代謝網(wǎng)絡(luò)中的任何反應(yīng)都可以從三個方面進(jìn)行控制：①相關(guān)的酶合成；②這些酶的共價修飾；③細(xì)胞內(nèi)底物和效應(yīng)物的濃度。原則上，這三個機(jī)制都會影響釀酒酵母中的丙酮酸的代謝。不過，人們理所當(dāng)然地對代謝節(jié)點上的底物濃度對代謝的影響給予了更多的關(guān)注。Holzer[96]最先指出細(xì)胞內(nèi)的丙酮酸濃度可能是調(diào)節(jié)釀酒酵母發(fā)酵和有氧呼吸的一個重要參數(shù)。后來，其他科學(xué)家觀察發(fā)現(xiàn)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的Km值跟丙酮酸脫羧酶的Km值相比要小一個數(shù)量級[97]。由此可以推出，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的丙酮酸處于很低濃度的時候，丙酮酸的進(jìn)一步代謝是由丙酮酸脫氫酶復(fù)合體催化的呼吸異化作用，而丙酮酸脫羧酶催化的反應(yīng)只能看作為一個旁路。相反，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)丙酮酸濃度很高的時候，丙酮酸的異化作用就主要是由丙酮酸脫羧酶催化進(jìn)行，從而產(chǎn)生大量的乙醇。這就是在有氧條件下，當(dāng)葡萄糖濃度很高的時候，引起細(xì)胞內(nèi)丙酮酸濃度增加，從而使代謝流向丙酮酸脫羧酶生成乙醇，這就是我們熟知的Crabtree效應(yīng)[66]。在討論不同的酶對同一種底物的競爭作用時，需要考慮到，酶和底物之間的親和力不能只由Km值來衡量。從米氏方程可以知道，當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r，反應(yīng)速率與底物濃度之間近似為一個一階方程。在底物濃度很低的條件下，由于細(xì)胞內(nèi)的酶的濃度也會影響到反應(yīng)速率，親和力應(yīng)該等于Vmax/Km而不是1/Km。在釀酒酵母中，即使是在限制葡萄糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行有氧呼吸時，丙酮酸脫羧酶的濃度還是很高的[98]。所以可以推測出高濃度的丙酮酸脫羧酶可以彌補(bǔ)它的高Km值，從而能與線粒體中的丙酮酸脫氫酶去競爭代謝丙酮酸。盡管如此，在有氧條件下，限制葡萄糖濃度的恒化器上培養(yǎng)釀酒酵母時，丙酮酸脫氫酶復(fù)合體催化的異化作用占絕對優(yōu)勢。但是不管丙酮酸脫氫酶對丙酮酸的競爭的優(yōu)勢有多大，也不可能完全阻止有丙酮酸由丙酮酸脫羧酶進(jìn)行催化。因為丙酮酸脫羧酶催化的反應(yīng)為細(xì)胞質(zhì)提供給了必需的乙酰輔酶A，盡管目前對細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的乙酰輔酶A到底是怎樣由丙酮酸脫羧酶催化生成的。參與釀酒酵母丙酮酸代謝的另外一個酶，丙酮酸羧化酶，由于它是以一種組成型的酶，它的酶活只受底物和效應(yīng)物的調(diào)節(jié)而不是酶合成的調(diào)節(jié)。要想增加丙酮酸羧化酶催化形成的產(chǎn)物草酰乙酸合成，就要先通過增加細(xì)胞生長來提高細(xì)胞內(nèi)的丙酮酸濃度。如果提高了細(xì)胞內(nèi)的丙酮酸濃度，就必然會增加代謝流向丙酮酸脫羧酶。因此，對草酰乙酸需求的增加是增加代謝流向丙酮酸脫羧酶的一個直接原因。這可能就是在有氧條件下，當(dāng)細(xì)胞快速生長時由呼吸作用轉(zhuǎn)向呼吸和發(fā)酵作用共存的原因。丙酮酸通過丙酮酸脫羧酶異化并不就等同于酒精發(fā)酵，因為形成的乙醛也可以進(jìn)入有氧呼吸。而且異化乙醛的關(guān)鍵酶的動力學(xué)性質(zhì)似乎更傾向于呼吸異化，因為，催化乙醛的乙醛脫氫酶的Km值比乙醇脫氫酶的Km值要低兩個數(shù)量級[99]。無論是在丙酮酸代謝節(jié)點上還是在乙醛的代謝節(jié)點上，都不只是酶對底物的親和力決定其代謝的命運(yùn)，調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶合成的輔因子和效應(yīng)物也對其代謝有很大的影響。比如在限制葡萄糖濃度培養(yǎng)基上培養(yǎng)酵母時，其代謝由呼吸轉(zhuǎn)向發(fā)酵在一定程度上就要受到乙醛脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶這兩種酶的合成的影響[98]。由此我們可以歸納得出，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)丙酮酸濃度很高的時候，丙酮酸更傾向于被丙酮酸脫羧酶催化分解，而使得丙酮酸脫氫酶復(fù)合體催化的反應(yīng)所占的比例很少。有丙酮酸脫羧酶催化的丙酮酸異化作用最終會流向酒精發(fā)酵。而丙酮酸羧化酶在丙酮酸的亦異化作用中也起到很大的作用。這就為如何調(diào)節(jié)丙酮酸流向丙酮酸脫羧酶，減少其流向丙酮酸脫氫酶復(fù)合體提供了依據(jù)。 釀酒酵母生產(chǎn)丙酮酸可行性分析，利用釀酒酵母來生產(chǎn)丙酮酸具有較好的優(yōu)勢：①釀酒酵母在厭氧條件或溢出代謝條件下，糖酵解代謝流旺盛，乙醇支路代謝流比例極高，若能夠有效將乙醇產(chǎn)出轉(zhuǎn)化為丙酮酸積累，可以期望達(dá)到較高的丙酮酸產(chǎn)量；②釀酒酵母可代謝底物廣泛，而且釀酒酵母的大規(guī)模發(fā)酵和技術(shù)生產(chǎn)過程相對成熟；③釀酒酵母遺傳背景相對清晰，遺傳分子操作可行性高；④釀酒酵母自身的環(huán)境耐受性強(qiáng)，它可以耐受較低的pH條件及較高的糖類濃度，而且它對生物質(zhì)水解產(chǎn)物中的一些抑制因子具有較高的抵抗性，生長活力高。因此利用釀酒酵母來達(dá)到積累丙酮酸的目的可期望值較高。⑤釀酒酵母葡萄糖和丙酮酸的代謝都比較清楚，可以清楚地知道如何去控制代謝，加速葡萄糖到丙酮酸的代謝速度，從而又快又好地積累高濃度的丙酮酸。 基因敲除基因敲除(gene knockout)是通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，具有位點專一性強(qiáng)、打靶后目的片段可以與染色體DNA共同穩(wěn)定遺傳的特點，目前己成為一種較理想的改造生物遺傳物質(zhì)的實驗方法?；蚯贸夹g(shù)早在20世紀(jì)70年代就在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中得以應(yīng)用[100]。80年代初，胚胎干細(xì)胞((ES細(xì)胞)分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。1985年，首次證實的哺乳動物細(xì)胞中同源重組的存在，奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型。此后的幾年中，基因敲除技術(shù)得到了進(jìn)一步的發(fā)展和完善[101]?；蚯贸夹g(shù)在研究基因功能中發(fā)揮了巨大的作用。在釀酒酵母基因功能研究過程中基因敲除技術(shù)不斷的被改進(jìn)，得到訊速的發(fā)展?；蚯贸夹g(shù)主要是將構(gòu)建好的基因敲除序列組件轉(zhuǎn)化至細(xì)胞后由同源重組實現(xiàn)目標(biāo)基因的敲除。其中的基因敲除序列組件是在選擇標(biāo)記基因的兩側(cè)分別連接一段與目標(biāo)基因兩側(cè)同源的短片段構(gòu)成。同源重組的效率在很大程度上依賴于基因敲除組件提供的同源區(qū)域兩側(cè)的片斷長度[102]。不同物種發(fā)生同源重組所需的同源序列的長度也有所不同，如表12所示。在釀酒酵母同源重組實驗中用過的最小的同源片斷為35個堿基對[103]。一般使用的同源序列的長度為30～45個堿基對。對于一些基因要求60～90個堿基對長度的同源片段才能有效的介導(dǎo)同源重組。表12同源重組所需的序列的長度Table12 Length of homologous sequence needed for homologous rebinationSpeciesLength of homologous sequence(bp)Saccharomyces cerevisiae35～40Schizosaccharomyces pombe60～80Kluyveromyces lactis51～55Ashbya gossypii45Candida albicans60～100Escherichia coli42Streptomyces coelicolor39 本課題立題依據(jù)及研究內(nèi)容. 立題依據(jù)近年來對丙酮酸及丙酮酸系列產(chǎn)品的開發(fā)利用正日益深入，商業(yè)上的需求也持續(xù)增長。目前我國有約10家企業(yè)生產(chǎn)丙酮酸，他們大部分采用落后的酒石酸合成法，總產(chǎn)量約1000噸/年。丙酮酸是一種酮酸，性質(zhì)活潑，化工生產(chǎn)成本高，傳統(tǒng)的酒石酸法制取成本約8萬元，由復(fù)旦大學(xué)最新開發(fā)的乳酸乙酯空氣氧化法成本也在約5萬元左右。丙酮酸市場價格約8～9萬元/噸，而化學(xué)法的高成本造成生產(chǎn)企業(yè)無利可圖，嚴(yán)重限制了相關(guān)行業(yè)的發(fā)展。因此開展發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的研究就現(xiàn)得尤其重要，它可促進(jìn)有關(guān)行業(yè)的快速發(fā)展，減少對國外產(chǎn)品的依賴。生物發(fā)酵法具有原料來源廣泛，能耗低、污染少、成本低等特點，近年來人們開始把目光聚焦到發(fā)酵法的研究上來。日本學(xué)者經(jīng)過半個世紀(jì)的研究發(fā)現(xiàn)一種酵母菌能大量積累丙酮酸，他們根據(jù)代謝調(diào)控理論經(jīng)過進(jìn)一步誘變，選育出一系列的丙酮酸高產(chǎn)菌株，%，日本已于1989年實現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的工業(yè)化。近年來我國學(xué)者也開始研究發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸，但丙酮酸發(fā)酵濃度一直沒有跨越80g/L。根據(jù)同為代謝中間代謝產(chǎn)物的乳酸和檸檬酸的最高發(fā)酵水平可達(dá)200g/L這一事實，丙酮酸理應(yīng)在發(fā)酵液中積累更高數(shù)量。釀酒酵母耐性較強(qiáng)，可以減少中發(fā)酵過程中中和劑的添加，使丙酮酸的分離提取更簡單。而且釀酒酵母葡萄糖到丙酮酸代謝速度快，再加上釀酒酵母葡萄糖代謝與丙酮酸代謝的特點可以推測，通過使丙酮酸脫羧酶缺失，有望得到一株丙酮酸高產(chǎn)菌株。（1）以釀酒酵母Y2為出發(fā)菌株，質(zhì)粒TP1K經(jīng)NotⅠ 酶切后，回收pdc1基因敲除片段P1K，把P1K轉(zhuǎn)入Y2中，經(jīng)篩選驗證得到pdc1基因敲除菌株Y21△。（2）以釀酒酵母Y21△為出發(fā)菌株，質(zhì)粒TP5H經(jīng)NotⅠ 酶切后，回收pdc5基因敲除片段P5H，把P5H轉(zhuǎn)入Y21△中，經(jīng)篩選驗證得到pdc1與pdc5基因同時敲除的菌株Y21△5△。（3）測定YY21△、Y21△5△的丙酮酸脫羧酶的活性，比較敲除基因之后酶活的變化。（4）用southern blot 實驗驗證基因敲除菌株。（5）優(yōu)化Y21△5△發(fā)酵產(chǎn)丙酮酸的種子培養(yǎng)基。（6）優(yōu)化Y21△5△發(fā)酵產(chǎn)丙酮酸的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。17天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文2 材料與方法 實驗材料 菌種和質(zhì)粒（1）釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y2單倍體（Mata，his，leu，thr），實驗室保存。（2）質(zhì)粒TP1K，含有pdc1基因敲除片段P1K；質(zhì)粒TP5H，含有pdc5基因敲除片段P5H。本實驗室構(gòu)建 主要試劑 工具酶、分子量Marker和試劑盒 限制性內(nèi)切酶NotⅠ、BamHⅠ購于Fermentas公司，Taq酶購于天根生化科技公司。 1kb DNA Marker和DNA MarkerⅢ，購于天根生化科技公司。 1kb DNA Marker 購于TaKaRa Biotechnology公司。質(zhì)粒提取試劑盒購于上海捷瑞生物工程有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司。酵母基因組提取試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司。DIG DNA標(biāo)記試劑盒購于深圳萊伯克生物科技有限公司。DIG 雜交檢測試劑盒購于深圳萊伯克生物科技有限公司。EDTA 分析純天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠丙三醇分析純天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠異戊醇分析純天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠瓊脂粉生物級北京鼎國生物技術(shù)有限公司無水乙醇分析純天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠氯仿分析純天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠冰乙酸分析純天津市北方化玻采購銷售中心Tris超純級北京鼎國生物技術(shù)有限公司十二烷基磺酸鈉超純級北京鼎國生物技術(shù)有限公司山梨醇生物級北京鼎國生物技術(shù)有限公司瓊脂糖電泳級OXOID 公司Tris飽和酚生化級北京鼎國生物技術(shù)有限公司胰蛋白胨生化級OXOID 公司酵母提取物生化級OXOID 公司鮭魚精DNA分析純Sigma公司G418分析純Sigma公司PEG3350分析純Sigma公司醋酸鋰分析純天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心二硫蘇糖醇分析純北京seaskybio 公司考馬斯亮藍(lán)G250分析純寶生物牛血清蛋白分析純寶生物βNADH分析純Sigma公司硫酸分析純天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠亮氨酸分析純天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所蘇氨酸分析純天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所YNB分析純Sigma公司 主要儀器和設(shè)備儀器名稱生產(chǎn)廠家752紫外可見分光光度計天津市華偉科技發(fā)展有限公司電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫(yī)療儀器廠YP1200電子天平上海精科天平BS124S分析天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司HYG搖床上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司DELTA320 pH計梅特勒托利多儀器（上海）有限公司電熱鼓風(fēng)干燥箱天津天宇機(jī)電有限公司TGL16G臺式高速離心機(jī)上海醫(yī)用分析儀器廠XW80A旋渦混合儀海門市其林貝爾儀器制造有限公司移液器芬蘭BIOHIT公司電泳儀美國BIORAD公司電泳槽美國BIORAD公司Biometra 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