【正文】 ic Acid 專業(yè)名稱：發(fā)酵工程指導(dǎo)教師姓名：高年發(fā) 教授研究生姓名：鄧旭衡申請學位級別：工學碩士論文提交日期：2011年1月論文課題來源：自選學位授予單位：天津科技大學天 津 科 技 大 學學位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨立進行研究工作所取得的成果。作者簽名：日期： 年 月 日知識產(chǎn)權(quán)和專利權(quán)保護聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師具體指導(dǎo)下并得到相關(guān)研究經(jīng)費支持下完成的，其數(shù)據(jù)和研究成果歸屬于導(dǎo)師和作者本人，知識產(chǎn)權(quán)單位屬天津科技大學；所涉及的創(chuàng)造性發(fā)明的專利權(quán)及使用權(quán)完全歸天津科技大學所有。本人授權(quán)天津科技大學可以將本學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學位論文。目前生產(chǎn)丙酮酸的方法主要有化學合成法、生物催化法和生物發(fā)酵法。在厭氧條件和溢出代謝情況下，經(jīng)糖酵解生成的丙酮酸幾乎全部或大部分流向生產(chǎn)乙醇的支路，從而產(chǎn)生乙醇的積累；同時酵母細胞具有較高的耐受性，可以積累較高濃度的乙醇。然后把pdc5基因敲除菌株敲除片段用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到S. cerevisiae Y21△中，在YNBG平板上篩選轉(zhuǎn)化子，通過PCR驗證得到pdc1和pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y21△5△。為進一步提高S. cerevisiae Y21△5△的丙酮酸產(chǎn)量，對其種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，優(yōu)化后種子培養(yǎng)基為（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨10，酵母粉5，KH2PO4 1，MgSO4關(guān)鍵詞：丙酮酸；基因敲除；釀酒酵母；代謝工程；丙酮酸脫羧酶ABSTRACTPyruvic acid is an important organic acid, which widely used in production and research of chemical raw materials, pharmaceutical and agricultural chemical reagents medicin and agrochemicals. Currently, the methods for product pyruvic acid include chemical synthesis, biocatalysis and biological fermentation. However, the mon chemical synthesis and enzymatic synthesis are not suitable for mass production of pyruvic acid because they thave many shortings: the raw materials are rare, plex, costly and the products always is a racemic mixture, so the use of microbial synthesis of pyruvic acid is a trend. The main ideas and objectives of fermentative production of pyruvic acid are: (1) to reduce the further degradation and conversion of pyruvate。 the optimal fermentation medium is (g/L): glucose 80, peptone 20, yeast extract 10, sodium acetate , corn steep liquor 1%, KH2PO4 1, MgSO4丙酮酸是一種很弱的有機酸，天然存在于薄荷和蔗糖發(fā)酵液中，為生物體內(nèi)葡萄糖分解代謝的中間產(chǎn)物，它連接著糖酵解、三羧酸循環(huán)、發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)醇、糖原異生、轉(zhuǎn)氨作用等一系列重要的代謝途徑，是細胞代謝過程中關(guān)鍵的具有樞紐性地位的中間物質(zhì)。 在化工制藥領(lǐng)域丙酮酸及其鹽是一類重要的有機化工中間體，在有機合成工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用，用于酶法合成L色氨酸、L酪氨酸、L多巴；合成L半胱氨酸、L亮氨酸、維生素B6和B12等[2]，丙酮酸乙酯在構(gòu)成雜環(huán)化合物方面性能優(yōu)越，是農(nóng)藥合成中難以取代的原料和中間體，它被廣泛應(yīng)用于殺菌劑和除草劑的合成，是合成乙烯系聚合物、氫化阿托品酸、谷物保護劑等多種農(nóng)藥的起始原料[3]。丙酮酸鈣有效減肥的同時，它也是一種良好的鈣補充劑，含鈣量約為20%。 其他方面的應(yīng)用丙酮酸是測定伯醇及仲醇的重要試劑，是脂肪族胺的顯色劑等，它還廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)診斷試劑、檢測試劑。 化學催化合成法工業(yè)生產(chǎn)中主要應(yīng)用的有兩種：酒石酸法和乳酸(鹽)催化氧化法。以丙酮酸在食品工業(yè)中的應(yīng)用為例，盡管它是一種很有潛力的酸味劑，但由于其在價格上與其它有機酸相比過于昂貴。 乳酸(鹽)催化氧化法[8] [9]用乳酸作原料氧化脫氫一步法生產(chǎn)丙酮酸是最理想的，這也是目前研究的方向。酶法生產(chǎn)所涉及到的酶都是與丙酮酸代謝有關(guān)的酶，如：酒石酸脫水酶、甲醛脫氫酶、過氧化酶和乙醇酸氧化酶、乳酸氧化酶、乳酸脫氫酶等。完整細胞酶法是利用微生物中某一特定功能的酶完成由底物向丙酮酸的轉(zhuǎn)化。休止細胞法中固定化細胞的重復(fù)利用問題就是限制它廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素。當時，日本東麗工業(yè)株式會社(Toray Industries lnc.)的研究人員宮田令子(Miyata Reiko)和米原轍(Yonehara Tetsu)選育出一系列丙酮酸產(chǎn)量超過50g/L的球擬酵母(Torulopsis)菌株，使得發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的工業(yè)化成為可能[12]。根據(jù)代謝控制育種和發(fā)酵原理，要想在生物體內(nèi)大量積累丙酮酸，就必須進一步切斷或更確切地說是圖11 丙酮酸的代謝途徑及發(fā)酵機制 The metabolic pathway and fermentation mechanism of pyruvate減弱丙酮酸的進一步代謝支路，加速丙酮酸的合成速度，去除代謝產(chǎn)物的反饋阻遏或反饋抑制(圖11)。 發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢丙酮酸發(fā)酵的研究起始于二十世紀五十年代，六十年來人們一直在尋找產(chǎn)丙酮酸的最佳菌株。只有切斷或弱化丙酮酸的進一步代謝，才能達到使其在細胞中積累并分泌到胞外的目的。用此濃度篩選出的敏感型突變株進行丙酮酸發(fā)酵，結(jié)果丙酮酸的產(chǎn)量分別提高了32%%。對其中7株丙酮酸產(chǎn)量提高的突變株進行發(fā)酵性底物（葡萄糖）和非發(fā)酵性底物(甘油、乙酸)的利用能力測試，鑒定得到3株呼吸缺陷型突變株RD1RD17和RD18。Miyata[25]研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有的供試酵母菌中大量積累丙酮酸的都必須是某種或某些維生素的缺陷型， IF0005 (NA,BI,B6,Bio)， 在初始葡萄糖濃度為100 g/L的情況下發(fā)酵135小時后丙酮酸產(chǎn)量達480 mmol/L，較原養(yǎng)型提高了60%。利用優(yōu)化后的條件進行搖瓶發(fā)酵。占桂榮等[30]以光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)TP19為出發(fā)茵，經(jīng)過UV和DES復(fù)合誘變選育出一株不利用丙酮酸的高產(chǎn)菌(TP204)。S. cerevisiae TAM在起始葡萄糖濃度為100 g/L下，接種60小時后丙酮酸含量達100g/L，100h后丙酮酸終濃度達到135g/L。為了提高發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的競爭力，以后的研究工作應(yīng)集中在以下幾個方面：在保證細胞正常代謝的前提下，盡可能減少丙酮酸的降解或轉(zhuǎn)化，這是獲得丙酮酸高產(chǎn)量和高產(chǎn)率的必要條件；加快從葡萄糖到丙酮酸的代謝速度，以確保獲得丙酮酸的高生產(chǎn)強度。然而由于丙酮酸常用生產(chǎn)菌株光滑球擬酵母為條件致病菌，據(jù)報道[33][34]醫(yī)院真菌感染病源菌以白假絲酵母（%）、光滑球擬酵母（%）和熱帶假絲酵母菌為主，患者中以呼吸系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和血液系統(tǒng)疾病患者居多，因此不少人開始從其他種屬中選育丙酮酸生產(chǎn)菌。利用基因敲除技術(shù)使釀酒酵母丙酮酸脫羧酶缺失是丙酮酸高產(chǎn)菌株選育的一個發(fā)展趨勢。以上優(yōu)勢使得釀酒酵母的工業(yè)生物技術(shù)研究較熱，發(fā)酵生產(chǎn)的相關(guān)產(chǎn)物越來越多，除乙醇外，其他如甘油、丙二醇、有機酸、糖醇、L型3磷酸甘油、類固醇及異戊間二烯化合物等[37]等。要完成這些細胞功能的改進，需要應(yīng)用到生物信息學和遺傳工程，這些就是我們所說的代謝工程。1995年，Stephanopoulous[41]在《Metabolic engineeringPrinciples and methodologies》一書中將代謝工程定義為：利用DNA重組技術(shù)對特定的生化反應(yīng)進行修飾或引入新的反應(yīng)以定向改進產(chǎn)物的生成或細胞的性質(zhì)。相對于傳統(tǒng)意義上的育種，代謝工程手段有兩個突出優(yōu)勢：①可以對菌種直接進行修飾改造不會積累不利突變；②外源基因的引入可以使酵母獲得自身以外的新的性狀。特別是現(xiàn)在糧食危機和能源危機，更加需要利用代謝工程來擴展生物質(zhì)的利用范圍來生產(chǎn)特定的生物產(chǎn)品。所以，在研究釀酒酵母發(fā)酵時，不要只著眼于改變某一特定的方面來增加產(chǎn)物產(chǎn)量，而要從酵母本身出發(fā)從整體上去考慮來改進[57]。由釀酒酵母作為宿主已經(jīng)表達生產(chǎn)了大量的外源蛋白，這些蛋白廣泛應(yīng)用于疾病診斷和治療的藥物。 釀酒酵母代謝工程未來趨勢對釀酒酵母生物技術(shù)的應(yīng)用仍然在持續(xù)增加，特別是釀酒酵母的全基因序列公布以后，通過基因重組手段更加容易獲得特定的重組基因。在未來，這種基因芯片技術(shù)將產(chǎn)生有關(guān)于這個模式生物系統(tǒng)的巨大的生物信息，而這些信息將可能被用來進一步了解像人體細胞一樣的更高等的真核生物。毫無疑問，大量的新的技術(shù)在未來將會應(yīng)用到釀酒酵母上，加上現(xiàn)在已經(jīng)研究清楚的各種技術(shù)，釀酒酵母必將成為一個重要的有潛力的生物技術(shù)生產(chǎn)的細胞工廠。酵母細胞的這種完全呼吸狀態(tài)可以通過供氧的葡萄糖限制的分批培養(yǎng)或者低稀釋率的葡萄糖限制的恒化培養(yǎng)來實現(xiàn)。在高濃度葡萄糖條件下，原本與細胞膜上的兩個蛋白Snf3p和Rgt2p結(jié)合的Mth1p和Std1p，轉(zhuǎn)而結(jié)合SCFp和Grr1p蛋白，從而使得Rgt1對六碳糖轉(zhuǎn)運相關(guān)基因(HXT系列基因)的抑制作用喪失，從而增加HXT系列基因的轉(zhuǎn)錄，增加葡萄糖的轉(zhuǎn)運。 圖13 酵母細胞葡萄糖信號通路示意圖 diagram of glucose signaling pathway of the yeast cell另一條途徑(主要的葡萄糖抑制途徑):途徑中DNA結(jié)合蛋白Mig1起重要作用:當細胞感受低濃度葡萄糖時，Snf4蛋白結(jié)合Gal83p、Glc7p、Reg1p，通過Hxt2磷酸化作用而被激活，從而作用于Mig1，使其磷酸化，導(dǎo)致Mig1P從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)，Mig1偶聯(lián)的被抑制基因得以順利轉(zhuǎn)錄，這些基因包括呼吸作用部分基因、三羧酸循環(huán)基因以及其他碳源如麥芽糖、蔗糖等的代謝相關(guān)基因等。Hannu Maaheimo等[69]通過BDF13C labelingNMR分析釀酒酵母低葡萄糖濃度下(有氧和厭氧條件下)的碳源代謝情況，指出:細胞內(nèi)磷酸戊糖途徑只提供生物合成，不參與供能系統(tǒng)。從圖l4可以明顯看出釀酒酵母細胞在溢出代謝狀態(tài)下具有極高的乙醇代謝流向，通過合理利用乙醇的代謝流向，可以積累前提代謝物或延伸產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物，如丙酮酸、蘋果酸等。乙醛，NADH氧化反應(yīng)中的電子受體，是丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫羧酶催化生成的。因此丙酮酸必須首先穿過線粒體膜才能被丙酮酸脫氫酶復(fù)合體氧化。轉(zhuǎn)化丙酮酸生成乙酰輔酶A并不只是異化作用：乙酰輔酶A以及TCA循環(huán)中的某些中間代謝產(chǎn)物是一些并需的生物合成的基礎(chǔ)。這個重要的同化作用是由丙酮酸羧化酶催化的。其中在野生型釀酒酵母中，起主要表達作用的是pdc1，但是當用在pdc1基因缺失的突變株中，丙酮酸脫羧酶的活性降低的并不多，大概變?yōu)樵瓉淼?0%左右。pdc1和pdc5基因的充分表達需要pdc2基因的調(diào)控，因為pdc2基因能夠編碼一種轉(zhuǎn)錄激活因子[79]。在研究糖酵解途徑中各種酶的表達的時候發(fā)現(xiàn)，丙酮酸脫羧酶的活性與糖酵解途徑中的代謝產(chǎn)物有關(guān)，這說明丙酮酸脫羧酶的活性將會受到培養(yǎng)條件的影響[82]。 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體丙酮酸脫氫酶復(fù)合體位于細胞的線粒體中。另外的一個亞基X沒有催化功能，但是可能參與組裝這個復(fù)合體[86]。然后生成的2α羥基乙?；鵗PP被氧化生成的乙?；苯玉詈系紼2的輔因子上，再轉(zhuǎn)移到輔酶A與之結(jié)合形成乙酰輔酶A。現(xiàn)在已經(jīng)對編碼這個復(fù)合體的兩個亞基的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用進行了研究。如果想要完全除去對lpd1轉(zhuǎn)錄的抑制，那么需要HAP2/3/4共價結(jié)合到它的啟動子上[88]。丙酮酸羧化酶的活性除了受其直接催化的底物調(diào)節(jié)外，還受很多其它代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，比如乙酰輔酶A、棕櫚酰輔酶A和天冬氨酸。酵母的丙酮酸羧化酶在乙酰輔酶A濃度飽和時的活性比沒有乙酰輔酶A的時候要高3～4倍。天冬氨酸是丙酮酸羧化酶的非競爭抑制劑，而它的催化產(chǎn)物草酰乙酸則是一種競爭抑制劑[92]。向培養(yǎng)基中添加天冬氨酸，其丙酮酸羧化酶的活性會下降50%。兩個基因的轉(zhuǎn)錄水平都因酵母的生長時期不同而不同。不過，人們理所當然地對代謝節(jié)點上的底物濃度對代謝的影響給予了更多的關(guān)注。相反，當細胞內(nèi)丙酮酸濃度很高的時候，丙酮酸的異化作用就主要是由丙酮酸脫羧酶催化進行，從而產(chǎn)生大量的乙醇。在底物濃度很低的條件下，由于細胞內(nèi)的酶的濃度也會影響到反應(yīng)速率，親和力應(yīng)該等于Vmax/Km而不是1/Km。但是不管丙酮酸脫氫酶對丙酮酸的競爭的優(yōu)勢有多大，也不可能完全阻止有丙酮酸由丙酮酸脫羧酶進行催化。如果提高了細胞內(nèi)的丙酮酸濃度，就必然會增加代謝流向丙酮酸脫羧酶。而且異化乙醛的關(guān)鍵酶的動力學性質(zhì)似乎更傾向于呼吸異化，因為，催化乙醛的乙醛脫氫酶的Km值比乙醇脫氫酶的Km值要低兩個數(shù)量級[99]。有