pcr的定義、歷史與運(yùn)用-資料下載頁(yè)
2025-06-21 13:03本頁(yè)面
【正文】 增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。 （五）RSPCR法（RNAspecificPCR） 也稱為鏈特異性PCR，主要指用于 RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽(yáng)性而不影響PCR的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3ˊ端（A區(qū)）有20個(gè)核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端20個(gè)核苷酸（C區(qū)）為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使cDNA與多余引物分開(kāi)，再用和第二引物（C）以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，以后的PCR循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B區(qū)和引物C進(jìn)行擴(kuò)增加尾cDNA，而污染的DNA或質(zhì)粒DNA才不會(huì)被擴(kuò)增。 （六）抗污染引物法 該對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)通過(guò)病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點(diǎn)。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質(zhì)粒中，這一區(qū)域分成兩個(gè)區(qū)域與克隆位點(diǎn)被。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本，也不能擴(kuò)增出任何條帶，即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴(kuò)增，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽(yáng)性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。 四．其它PCR檢測(cè)方法： （一）兩步法：是指在用套式 PCR方法擴(kuò)增某些含量低微的標(biāo)本時(shí)，兩對(duì)引物在同一個(gè)管中以簡(jiǎn)化步驟，減少污染。通常第一步進(jìn)行2025個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增外引物片段；第二步再進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增內(nèi)引物片段。兩步法對(duì)內(nèi)外引物的Tm值有特殊要求，即內(nèi)外引物的退火溫度高（如68℃），在此溫度下內(nèi)引物不與模板退火，然后降低退火溫度（至 55℃）再擴(kuò)增內(nèi)引物片段，這樣，在操作過(guò)程中，僅打開(kāi)PCR反應(yīng)管一次，大大減少了污染的可能性。（二）熒光法：亦稱熒光PCR技術(shù)（fluoresencePCR,FPCR），是1995年由美國(guó)PE公司首先研制成功的，它融匯了 PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點(diǎn)，電腦同步跟蹤，數(shù)據(jù)自動(dòng)化處理，直接探測(cè)PCR過(guò)程中的變化以獲得定量的結(jié)果，不需要做 PCR后處理或檢測(cè)，完全閉管操作。探針標(biāo)記除用TET和FAM外，還可用HEX、JOE作為報(bào)告熒光，3′端的淬滅基團(tuán)常用TAMRA。在探針保持完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光被熒光抑制基團(tuán)淬滅，而在探針被切斷后，熒光報(bào)告基團(tuán)才發(fā)出報(bào)告熒光，且熒光的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正比。熒光檢測(cè)儀器透過(guò) PCR管壁能直接檢測(cè)到熒光信號(hào)的波長(zhǎng)和長(zhǎng)度變化。 主要有以下優(yōu)點(diǎn)： ，假陽(yáng)性率低； ，不需要 PCR后處理； ，HBV(102106Dane′sparticle/ml)； 4. 閉管操作，PCR產(chǎn)物污染少； 。 主要方法有： 1..熒光探針?lè)ǎ哼M(jìn)行熒光PCR檢測(cè)時(shí)，要求熒光探針必須完全與靶基因互補(bǔ)，長(zhǎng)度以2030個(gè)堿基為宜，必要時(shí)3′端磷酸化封閉，以防在擴(kuò)增時(shí)作為引物延伸。該方法利用Taq酶的3′→5′聚合酶活性及5′→3′ 外切酶活性，可以在鏈延伸過(guò)程中實(shí)現(xiàn)鏈替換，并將被替換的探針切斷，故可進(jìn)行定性與定量檢測(cè)。 熒光探針5′端標(biāo)記的TAMRA，在480nm 激發(fā)下產(chǎn)生530nm的紅色熒光；3′端標(biāo)記的FAM，激發(fā)后產(chǎn)生綠色熒光。PE公司推出的TaqMan系統(tǒng)，即采用雙熒光探針，如配合使用PCR擴(kuò)增與熒光檢測(cè)合二為一的儀器，可進(jìn)行實(shí)時(shí)（realtime）定量檢測(cè)。 2．分子信標(biāo)法：分子信標(biāo)（molecularbeacon）是一個(gè)發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的特異探針，其環(huán)狀部分與靶序列互補(bǔ)。在室溫時(shí)，分子信標(biāo)的發(fā)夾緊閉，熒光淬滅。PCR擴(kuò)增時(shí)，隨著溫度升高，發(fā)夾松開(kāi)，與單鏈模板特異結(jié)合，發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)度與模板呈正比，故可用于PCR產(chǎn)物的定性及定量。 總之，人類在邁入廿一世紀(jì)中即將出現(xiàn)若干的突破，生物醫(yī)學(xué)便是其中重要的一項(xiàng)。在過(guò)去三、四十年耒，像PCR這樣影響深遠(yuǎn)的技術(shù)實(shí)在很難找到。它的震撼,除了眾多的得獎(jiǎng)外(包括諾貝爾獎(jiǎng)),更在于它的可塑性、修飾性及全方位的運(yùn)用。未來(lái)的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，它也必定繼續(xù)扮演舉足輕重的角色。7 /
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