【正文】 也詳細說明了電轉，化學轉化（EasyComp和LiCl）方法的過程，可以按部就班。需要注意的是：（電轉過程）①最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養(yǎng)過的酵母放置時間不要超過一個星期；②擴大培養(yǎng)的濃度一定要控制好，，這個時候的酵母比較新鮮，轉化率比較高；③整個感受態(tài)制作過程中一定要在冰上操作，離心最好也用冷凍離心機，這是影響轉化的關鍵——為了進一步保證這一點，無菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和電轉杯都要預冷；④電轉儀需要預熱，所以準備感受態(tài)的時候就可以把電轉儀打開了，電轉后山梨醇的加入要快，曾有人做實驗證明晚一秒就會降低轉化的數(shù)量級，雖然不一定可信，但是我個人也認為這個過程要快，電轉后可以看看時間，如果時間過短（比如〈4）就可能說明雜質較多，會影響轉化率；⑤轉化后溫育是個增加同源重組，增加存活率的過程，需要注意不要感染了大腸桿菌，再加入培養(yǎng)基30℃搖一段時間，可以取部分涂板（不同濃度抗生素），或者也有人將菌短暫離心，棄去上清，剩余全部涂板以保證轉化率。（化學轉化）如果沒有電轉儀，LiCl轉化是一種可供選擇的方法，轉化率是102到103cfu/ug。主要過程為：取過夜活化培養(yǎng)的菌液按1：1000接種于15ml新鮮的YPD液體培養(yǎng)基，30℃；4℃，4500rpm離心5分鐘，用8ml冰預冷的無菌水洗滌菌體，傾除洗滌液，用1mL，4℃，4500rpm離心5分鐘，沉淀用50μl冰預冷的100mmol/L LiCl懸浮，最后定容至8090ml。LiCl轉化 取適量單鏈鮭精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上備用，取上述制備好的感受態(tài)細胞12000rpm，離心15s，吸棄LiCl溶液，按順序依次加入50%PEG 240ml1mmol/L LiCl 36 ml單鏈鮭精DNA 25ml線性化質粒DNA 10 ml (約10mg)用吸頭反復吹打，使細胞沉淀與加入的溶液混勻，30℃靜置溫育30min，42℃熱擊2025min，4500rpm離心10min，吸棄轉化液，細胞沉淀加1mlYPD培養(yǎng)基于30℃ 200 rpm培養(yǎng)24hr，取轉化混合液100ml涂布含100181。g/mL ZeocinTM的YPDS平板，30℃培養(yǎng)23天。第三步——挑克隆篩選XiangYang：在protocol中用了許多篇幅來指導這一步，包括如何去通過平板篩選，觀測生長速率來確定Mut表現(xiàn)型等。這個過程需要3到5天，而我一般只用用了4個小時進行PCR（AOX引物）篩選。leslie：完成轉化后就是克隆鑒定的過程了，包括高拷貝篩選，PCR鑒定和表型鑒定的過程，其中我做的比較多的是PCR鑒定（因為比較快），具體過程protocol上說的很清楚，其實也很簡單，就是凍融破菌進行菌落PCR，但是其中許多具體細節(jié)問題也挺讓人頭痛的，第一就是破壁的問題，許多人用PCR方法進行鑒定都無法得到結果，甚至在表達出了以后還是無法得到這張鑒定圖片，主要原因之一就是無法正常釋放酵母基因組，一般通過培養(yǎng)菌然后進行沸水和20℃冷凍循環(huán)過程裂解細胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以內(nèi)是可以得到好的結果的，但是有時候片段過長，模壁就會阻礙擴增，所以我們實驗室會用蝸牛酶（很便宜的酶來的）來幫助溶菌，我看許多實驗室也會這么做，不過加入的時間不同而已，其次也有奢侈的用試劑盒的。第二就是是模板量，個人建議模板真的不要加太多了，按照說明書的上的5ul我覺得還是多了，而且建議總體積不用這么大，當然加入模板的量也與自己培養(yǎng)菌的濃度以及用來凍融的菌數(shù)量有關。其次是假陽性和假陰性結果，在Mut和Mut+情況是不一樣的，如果用的是539。AOX引物，而Mut+則會出現(xiàn)AOX1基因原本長度的片段——，因此如果的基因片段長度相似，要注意區(qū)分。建議PCR過程中使用多對引物進行反應，包括自己基因的，αfactor的，539。AOX的，都可以，反正各種對照多了有利于比較——當然前提是你不能暈了頭。掉了毛的鴕鳥：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶1(AOX1)基因的啟動子的轉錄終止子(5’AOX1和3’AOX1),他們被多克隆位點分開,外源基因可在此插入,此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標記（HIS4區(qū)的整合方式為位點特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主（his4），因而可利用表型差異進行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而具有HIS＋表型以篩選轉化子.）及3’AOX1區(qū),當整合型載體轉化受體菌感受態(tài)細胞時,他的5’AOX1和3’AOX1能與染色體上的同源基因重組,從而使整個載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中,外源基因在5’(抗G418)有助于篩選高拷貝轉化子,轉化子的拷貝數(shù)與抗G418的能力有關,因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩(wěn)定表達外源蛋白，具有良好的遺傳穩(wěn)定性.第四步——表達XiangYang：，就可以離心收菌。用表達培養(yǎng)基（比如BMMY）重懸沉淀，在30186。C培育過夜。leslie：篩選鑒定出自己的重組子可以說什么都不能證明，還是要看這一步的酵母表達，有許多人在酵母表達上花費了大量的時間——不同于大腸桿菌的兩天出結果，一次畢赤酵母的表達就需要起碼一周的時間，篩選了上百上千的克隆，但是仍然是竹籃打水一場空，我個人建議如果在篩選完3批以上就可以放棄這一批轉化的酵母菌，另外調(diào)整進行重新轉化。另外剛開始的時候可以用小量表達，可以用5ml：生長慢型，生長快型，陰性對照（空質粒），陽性對照（可以是曾經(jīng)表達成功的重組子）和沒有進行轉化的酵母菌的單克隆，BMGY中培養(yǎng)到OD值26，離心收菌（如果怕污染或者麻煩，可以放置酵母菌一段時間，一半為2030分鐘，讓菌沉淀下來，小心傾倒去上清培養(yǎng)基獲得菌），轉入BMMY中誘導表達，這些步驟都需要在超凈工作臺里進行，如果要區(qū)分是否染菌，可以取一些到顯微鏡下觀察，或者聞氣味（酸甜的是酵母），觀顏色（乳白色的是酵母）。除此之外，如果是小量表達，有可能會在沒有達到4天的時間培養(yǎng)基就干了，所以可以適當補充一些，以及在搖床里放置盛有無菌水的深口瓶，來保持搖床里濕度。誘導物甲醇注意要在超凈臺中打開，可以分裝到滅過菌的瓶子中——當然甲醇是不能滅菌的，而且也要注意在用酒精燈過甲醇瓶口的時候要小心，如果真的引起爆炸那可就損失大了。另外如果覺得每天添加甲醇麻煩，也有人用一次性注射器透過紗布添加甲醇，這個方法可能會造成染菌，慎選。說到紗布就想到了通氣性問題，酵母在無氧和有氧的情況下都可以存活，但是在甲醇誘導的情況下畢赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧氣量對于這一基因的表達影響重大，但是由于害怕感染大腸桿菌，紗布裹的也不能太少，最好專辟出一個搖床進行三十度酵母表達，這樣可以考慮將紗布減少到3—5層，同時需要注意的是搖瓶內(nèi)菌液體積不要超過1030%。每天取樣出來進行SDSPAGE電泳鑒定，能這樣最好，不過每天做膠跑膠染色真的很麻煩，可以匯集一批同時跑，不過樣品一定要煮過凍存，而且每次取樣不要反復凍融，最好分裝保存——因為蛋白經(jīng)煮沸變性會不穩(wěn)定，容易降解。另外為了防止蛋白在分泌出來的過程就降解了（特別是小分子蛋白），也可以通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值抑制蛋白水解酶的活性（這一方面說明書講解得詳細），還可以加入酪蛋白氨基酸等保護物質，競爭性抑制蛋白水解酶的活性來防止表達產(chǎn)物降解。如果使用的是分泌型培養(yǎng)基，按道理收集培養(yǎng)基上清就可以進行下一步分析了，但是由于培養(yǎng)基中的蛋白濃度PAGE膠一般是檢測不出來的——除非你的表達蛋白量非常大。所以需要進行濃縮，方法有TCA法，硫酸氨鹽析，PEG沉淀，透析，超濾等等，當然最簡單的就是煮沸蒸發(fā)水分濃縮了。另外跑膠的時候同時對照酵母胞內(nèi)蛋白，以防沒有分泌出來。SDSPAGE的配置參見分子克隆，注意你的蛋白大小與膠的濃度的對應性，如果小到20kD以下，可以考慮用tricine膠，不過是個需要全盤重新準備的過程，要考慮清楚。如果選用的載體是帶有信號肽的，雖說是分泌表達好純化，但實際上畢赤酵母本身還是有本底表達的，而且有時候會造成假陽性，所以最后表達過程需要用Westernblot或者Elasa，通常都是用WB，具體的細節(jié)可見WesternBlotting前傳：想成為高手嗎？系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白沒有合適抗體（如果是利用從大腸表達出來的蛋白做出的抗體也有可能與用真核系統(tǒng)表達出來的蛋白無法發(fā)生免疫作用），可以選用antimyc或者antihis的，前提當然是你的蛋白沒有提前終止。其它在表達中可能出現(xiàn)的情況包括表達量低，沒有分泌表達（針對pPICZa系列），頭兩天蛋白量較大，無法重復，表達出來的蛋白偏大等等，需要分各個方面分析原因，比如蛋白明明加上了信號肽，但是就是無法分泌出來，這可能是蛋白結構在通過細胞膜的時候受到了阻礙，可能需要重新轉化，更換線性化位點或者更換菌株；如果蛋白表達第一天較高，但是之后越來越少，這很有可能是蛋白降解了或者產(chǎn)生了競爭表達；畢赤酵母無法重復的問題比較嚴重，許多情況下在第一次獲得了高量表達之后就再怎么也重復不了這個結果，遇到這種情況真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索條件還能怎么樣呢？而表達出來的蛋白分子量偏大則是個正常現(xiàn)象，除了糖基化以外還有其它原因，比如二聚體，這些需要進行WB或進一步實驗驗證。第五步——發(fā)酵和產(chǎn)物純化Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns（GEHealthcare），經(jīng)過簡單的純化之后我可以得到90%的目的蛋白。我的目的蛋白是一個大小為45kDa，可以通過二硫鍵形成反向平行二聚體（antiparallelhomodimer）的糖蛋白，經(jīng)過純化，我通過一個細胞增殖實驗（cell proliferationassay）檢測了其活性，結果表明表達出來的蛋白在體外有完全的活性。并且我也在體外利用受體分析了蛋白結合活性，與對照（通過大腸桿菌和Bacular細胞未帶tag的蛋白）相比，histag有一點副作用。伊可麗：由于在搖瓶培養(yǎng)中巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的水平往往不能準確地反映罐發(fā)酵中的表達情況，使之成為令人頭痛的問題。主要原因是在搖瓶培養(yǎng)中，培養(yǎng)液的pH值無法控制，培養(yǎng)物通氣不充分及無法控制添加碳源的最適速率。但是為了避免對每一個表達菌株進行繁瑣的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的實驗，仍需摸索表達菌株的搖瓶培養(yǎng)條件，使其產(chǎn)物的表達量與預期的發(fā)酵罐培養(yǎng)結果相近?？偠灾?，EasySelect系統(tǒng)是一個便于操作的酵母表達系統(tǒng)，我已經(jīng)使用這一系統(tǒng)表達過15個類似物了，每一個我都獲得了超過1mg/1升培養(yǎng)液的純化蛋白。