【正文】 始密碼子），有人認為酵母啟動子與外源基因的ATG之間的距離越短對于表達的該基因越有利；⑤如果不希望有cmyc和Histag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；⑥Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關基因表達偏好密碼子的問題有人認為沒有必要更換，有人認為一定要換，個人認為以產量為主要目的的可以考慮更換基因密碼子，而如果片段過長就比較麻煩，不過有許多真核保守蛋白其實是和酵母密碼子相似的；⑦克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養(yǎng)基要用低鹽培養(yǎng)基（NaCl減半），這主要是因為怕影響到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；⑧測序引物可以用αfactor信號引物，也可以用539。第二步就是將線性化的DNA轉化入Pichia酵母中。leslie：在得到了正確的序列之后就可以準備轉化畢赤酵母了，試劑盒攜帶有的是X33，GS115和KM71H這三種畢赤酵母（另外常用的還有SMD1168），每種酵母的特點有些不盡相同（Manual上寫的很清楚），其中X33由于是野生型，因此耐受性比較好，如果擔心轉化率的話可以考慮這種酵母菌，而GS115與X33一樣都是屬于MUT＋表現(xiàn)型，也就是說可以在含甲醇的培養(yǎng)基中快速生長，但是據(jù)說會對外源基因表達有影響，KM71是MUT型酵母，在甲醇培養(yǎng)基中生長緩慢，但是也有利于翻譯后加工，比如形成二硫鍵，糖基化等等，另外SMD1168則是基因組中的Pep4基因發(fā)生突變，造成蛋白水解酶活性的喪失，可以保護表達產物免受降解，促進表達量的提高。另外有個保存問題，原始酵母菌一定要保存好，因為酵母在傳代多次后會影響其轉化率和表達量，所以一方面分多管分裝保存于80℃，另一方面如果出現(xiàn)了轉化或者表達的問題，在其它方面都沒有出錯的前提下可以考慮重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。在線性化之后的質粒就可以酒精沉淀回收了——中間步驟需要使酶失活，說明書建議是熱失活或者EDTA，個人認為前者比較好，主要是擔心EDTA對于轉化的影響，另外這三種酶失活的溫度都是65℃/20min。需要注意的是：（電轉過程）①最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養(yǎng)過的酵母放置時間不要超過一個星期；②擴大培養(yǎng)的濃度一定要控制好，這個時候的酵母比較新鮮，轉化率比較高；③整個感受態(tài)制作過程中一定要在冰上操作，離心最好也用冷凍離心機，這是影響轉化的關鍵——為了進一步保證這一點，無菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和電轉杯都要預冷；④電轉儀需要預熱，所以準備感受態(tài)的時候就可以把電轉儀打開了，電轉后山梨醇的加入要快，曾有人做實驗證明晚一秒就會降低轉化的數(shù)量級，雖然不一定可信，但是我個人也認為這個過程要快，電轉后可以看看時間，如果時間過短（比如〈4）就可能說明雜質較多，會影響轉化率；⑤轉化后溫育是個增加同源重組，增加存活率的過程，需要注意不要感染了大腸桿菌，再加入培養(yǎng)基30℃搖一段時間，可以取部分涂板（不同濃度抗生素），或者也有人將菌短暫離心，棄去上清，剩余全部涂板以保證轉化率。g/mL ZeocinTM的YPDS平板，30℃培養(yǎng)23天。第二就是是模板量，個人建議模板真的不要加太多了，按照說明書的上的5ul我覺得還是多了，而且建議總體積不用這么大，當然加入模板的量也與自己培養(yǎng)菌的濃度以及用來凍融的菌數(shù)量有關。AOX的，都可以，反正各種對照多了有利于比較——當然前提是你不能暈了頭。leslie：篩選鑒定出自己的重組子可以說什么都不能證明，還是要看這一步的酵母表達，有許多人在酵母表達上花費了大量的時間——不同于大腸桿菌的兩天出結果，一次畢赤酵母的表達就需要起碼一周的時間，篩選了上百上千的克隆，但是仍然是竹籃打水一場空，我個人建議如果在篩選完3批以上就可以放棄這一批轉化的酵母菌，另外調整進行重新轉化。另外如果覺得每天添加甲醇麻煩，也有人用一次性注射器透過紗布添加甲醇，這個方法可能會造成染菌，慎選。如果使用的是分泌型培養(yǎng)基，按道理收集培養(yǎng)基上清就可以進行下一步分析了，但是由于培養(yǎng)基中的蛋白濃度PAGE膠一般是檢測不出來的——除非你的表達蛋白量非常大。如果選用的載體是帶有信號肽的，雖說是分泌表達好純化，但實際上畢赤酵母本身還是有本底表達的，而且有時候會造成假陽性，所以最后表達過程需要用Westernblot或者Elasa，通常都是用WB，具體的細節(jié)可見WesternBlotting前傳：想成為高手嗎？系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白沒有合適抗體（如果是利用從大腸表達出來的蛋白做出的抗體也有可能與用真核系統(tǒng)表達出來的蛋白無法發(fā)生免疫作用），可以選用antimyc或者antihis的，前提當然是你的蛋白沒有提前終止。并且我也在體外利用受體分析了蛋白結合活性，與對照（通過大腸桿菌和Bacular細胞未帶tag的蛋白）相比，histag有一點副作用?？偠灾?，EasySelect系統(tǒng)是一個便于操作的酵母表達系統(tǒng)，我已經使用這一系統(tǒng)表達過15個類似物了，每一個我都獲得了超過1mg/1升培養(yǎng)液的純化蛋白。主要原因是在搖瓶培養(yǎng)中，培養(yǎng)液的pH值無法控制，培養(yǎng)物通氣不充分及無法控制添加碳源的最適速率。第五步——發(fā)酵和產物純化Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns（GEHealthcare），經過簡單的純化之后我可以得到90%的目的蛋白。另外跑膠的時候同時對照酵母胞內蛋白，以防沒有分泌出來。每天取樣出來進行SDSPAGE電泳鑒定，能這樣最好，不過每天做膠跑膠染色真的很麻煩，可以匯集一批同時跑，不過樣品一定要煮過凍存，而且每次取樣不要反復凍融，最好分裝保存——因為蛋白經煮沸變性會不穩(wěn)定，容易降解。除此之外，如果是小量表達，有可能會在沒有達到4天的時間培養(yǎng)基就干了，所以可以適當補充一些，以及在搖床里放置盛有無菌水的深口瓶，來保持搖床里濕度。用表達培養(yǎng)基（比如BMMY）重懸沉淀，在30186。AOX引物，而Mut+則會出現(xiàn)AOX1基因原本長度的片段——，因此如果的基因片段長度相似，要注意區(qū)分。這個過程需要3到5天，而我一般只用用了4個小時進行PCR（AOX引物）篩選。主要過程為：取過夜活化培養(yǎng)的菌液按1：1000接種于15ml新鮮的YPD液體培養(yǎng)基，30℃；4℃，4500rpm離心5分鐘，用8ml冰預冷的無菌水洗滌菌體，傾除洗滌液，用1mL，4℃，4500rpm離心5分鐘，沉淀用50μl冰預冷的100mmol/L LiCl懸浮，最后定容至8090ml。接下來就是酵母轉化了，這是令許多人頭疼的一步，也是影響實驗決定表達的關鍵步驟。在轉化前質粒需要進行線性化，這主要是為了增加重組率（EasySelect試劑盒表達量高的一個重要原因也就在于其原理是將目的片段整合到載體上，大大的增加了目的片段的表達）。而對于分泌蛋白的表達，無論是甲醇利用慢(Mut)還是甲醇利用快(Mut+)的細胞都可應用，如在人血清白蛋白(HSA)(為分泌型蛋白)的表達中就看不出兩種類型的細胞之間有什么明顯差別。我傾向于選擇X33，因為這個菌株轉化率和表達量相對而言較高，如果你有電轉儀（electroporator），可以嘗試一下。⑩目的基因中最好不要含有progluserthr這樣的序列，因為這個序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會影響表達，另外也不要含有xphexarggln和glnargxphex這樣的序列（x=任何氨基酸），因為這些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser這樣的氨基酸。大家做畢赤表達的時候應該都遇過這種情況吧，表達過程中染菌（我們實驗室曾經污染過各種顏色形狀的細菌，那真是一段可怕的經歷），如果在不知情的情況下繼續(xù)做下去，那可以就是浪費大把的時間了。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標記，而誘導表達的載體需要甲醇——甲醇比一般用于大腸桿菌表達誘導使用的IPTG便宜。畢赤酵母表達載體pPICZ在多克隆位點（MCR）339。其中Xiang Yang是來自美國喬治城大學（Georgetown University）Lombardi癌癥中心（Lombardi Cancer Center），部分用戶來自國內。各位園友誰比較了解這方面，望多多指教！有沒有人試過低溫表達酵母(30以下), 據(jù)說有助于蛋白結構的折疊,對分泌表達也有好處. 試過的請說一下,在什么溫度下表達,效果如何?我做的就是在28度下表達的，量還可以至于對于空間結構的影響沒有鑒定過.但是還是有很多人用以α因子為信號肽的載體并得到了成功表達。所以請教一下高手們關于各種信號肽及其切割位點的信息。蛋白質幾次凍融應該沒大的問題，故先分裝20度冷凍保存。我沒有能從NCBI上查到酵母中這兩個基因的序列。但是在基因優(yōu)化過程中一味地選用高效密碼子或單一地消除二級結構都不見得有好的效果。如果說還有一部比較關鍵的話，也許再加一步分泌（在此，只討論分泌型表達的情況），這樣就算作三步：轉錄、翻譯、分泌。某些外源性蛋白在酵母中表達不理想，但經過基因優(yōu)化以后有不少蛋白還是可以獲得一定量的表達。緩沖液：細胞裂解液 : TrisHcl (pH )50mM EDTA1% SDSEDTASark: EDTA(pH )2% SarkosylTE : 10mM TrisHcl1mM EDTA (pH )to 超馬兄，你說的細胞內外的蛋白都是一樣的，我倒是沒做過驗證，但是我總覺得細胞內的應該是帶有信號肽的，如果你說的正確的話，那么也就是說，當信號肽分泌到細胞膜的時候，Kex2信號肽酶切割完了又回到胞內了？還是外源蛋白有ATG，信號肽沒有翻譯，直接從你的外源基因開始翻譯？望賜教！我上次表達的外源蛋白沒有自身的ATG，而且沒有kex2酶切序列（當時怕酶切不完全，沒有設計），我想信號肽應該是在內質網完成切割的，停留在胞內進行糖基化，磷酸化等修飾。13) 加入 50ul EDTASark 和3ul RNase (10mg/ml) ,在37℃孵育30分鐘。10) 加入500ul SEVAG(24:1 氯仿: 異丙醇), 用手劇烈搖1 分鐘,13200rpm 離心1 分鐘。.7）2000rpm 離心2 minute。3）用3ml 滅菌水洗細胞，離心去上清。請問個位戰(zhàn)友：煮凍煮提酵母DNA方法很靈驗么為什么我做了兩次都沒有呀用了5AOX和3AOX引物和目的基因的引物