【正文】 輔基起作用。，再高了效率會(huì)很低關(guān)于高效轉(zhuǎn)化法，文獻(xiàn)說用(LiAc)，而invitrogen的說明書說轉(zhuǎn)化畢赤酵母用(LiAc)沒用，要用LiCl。glucose和含氮化合物在一起容易產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，這是配制培養(yǎng)基中的禁忌。像目前國內(nèi)外做的最好的rHSA，最適pH大概56左右，也有不同的報(bào)道，可能和工藝頁有關(guān)系。謝謝了，我在上海。我用Pichia酵母分泌表達(dá)兩個(gè)不同的蛋白，結(jié)果Western Blot的結(jié)果顯示，兩個(gè)蛋白均比理論分子量少了20k左右。他本來說離心取上清為模板，我就直接取的。萬事都沒那么覺對(duì)的，在整合時(shí)，可能僅His4基因整合入了酵母基因組，所以也能生長(zhǎng)，但無目的基因。小量搖瓶表達(dá)的時(shí)候需要保證氧通量而使用雙層紗布包住瓶口嗎？還是直接用牛皮紙包住就行了？一般說來，小瓶發(fā)酵的時(shí)候只需要用牛皮紙包住瓶口就可以了，搖床的速度不要過快，那樣會(huì)使得通氣量不夠，小瓶發(fā)酵時(shí)由于不添加消泡劑所以應(yīng)該避免搖速過快而引起得泡沫。如果不怕麻煩，做一下Northern鑒定，或者直接突變掉一兩個(gè)堿基。BCA法應(yīng)該也可以，但是6g/L的總蛋白濃度似乎太高，不過也有可能，因?yàn)?升培養(yǎng)基你加了10g酪蛋白氨基酸。其他試劑我都重新配過了應(yīng)該沒有問題。在起始條件下，可能某一因素是限制條件，如基因劑量。哎！我的問題解決了！?。。。?！冷丙酮造成的鹽共沉淀，不是蛋白沉淀！?。。。】磥砦业姆置诒磉_(dá)量是太少了，做了半年了，哎！?。?！我該如何優(yōu)化表達(dá)條件，提高表達(dá)量呢？？我半年的工作時(shí)間呀！?。。。?！我也碰到了類似問題。，可以通過雜交法準(zhǔn)確確定拷貝數(shù)的，說明書上提到了。，1％比例，可作為保護(hù)劑。4）把細(xì)胞懸浮在500ul 細(xì)胞裂解液中， Eppendorf管中。用1ml的移液槍把水相（上層）轉(zhuǎn)到一個(gè)干凈的Eppendorf管中。這樣胞內(nèi)帶信號(hào)肽的外源蛋白量很少，western的時(shí)候看不出來，而切了信號(hào)肽的外源蛋白占了絕大多數(shù)，不知我說的是否正確？.這次我要表達(dá)的外源基因沒有自身的信號(hào)肽，為一個(gè)膜蛋白，我想是否 需要將它自身的ATG也要設(shè)計(jì)進(jìn)去呢？謝謝你說的“信號(hào)肽應(yīng)該是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完成切割的，停留在胞內(nèi)進(jìn)行糖基化，磷酸化等修飾。那一步有問題都將導(dǎo)致表達(dá)量過低，但就我個(gè)人認(rèn)為轉(zhuǎn)綠應(yīng)該不是大問題，諸如密碼子優(yōu)化、二級(jí)結(jié)構(gòu)消除等優(yōu)化策略均直指翻譯一步且效果不錯(cuò)，最近看到一篇文獻(xiàn)，作者針對(duì)于其表達(dá)的基因從mRNA水平、蛋白質(zhì)水平分別進(jìn)行了檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型低表達(dá)與優(yōu)化后告表達(dá)在mRNA水平上無明顯差別，而在蛋白質(zhì)水平有較大差別。希望有哪位知道的施舍一下。幾天以后：最近查了一些文獻(xiàn)，α因子信號(hào)肽包含83個(gè)氨基酸殘基的前導(dǎo)肽及后面一段由lys—Arg(Glu—Ala)l2或Lys—Arg—Glu—Ala—Asp—Ala氨基酸序列組成的間隔肽。甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)有不少優(yōu)點(diǎn)，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)最為人熟知，并廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)。端帶有histag和cmyc epitopes，這些tag有利于常規(guī)檢測(cè)和純化，而且在MCR539?；臼煜ち水叧嘟湍?，了解了她生長(zhǎng)的喜好（多糖偏酸環(huán)境），生長(zhǎng)的周期等等情況后，當(dāng)然更多的精力還是應(yīng)該花在表達(dá)的目的蛋白上，我的表達(dá)蛋白有些恐怖，有100KD，本來當(dāng)然應(yīng)該放在大腸桿菌中表達(dá)，但是為了分泌表達(dá)（其實(shí)后來發(fā)現(xiàn)大腸桿菌pET系列分泌表達(dá)系列也不錯(cuò)）和糖基化修飾（主要是這個(gè)方面，因?yàn)槲业牡鞍资侨嗽吹?，表達(dá)出來用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾）。如果沒有的話，EasySelect也準(zhǔn)備了化學(xué)轉(zhuǎn)化試劑——EasyCompTransformation，但是由于轉(zhuǎn)化率的緣故，我建議使用電轉(zhuǎn)儀。線性化位點(diǎn)個(gè)人認(rèn)為也會(huì)影響到表達(dá)量，對(duì)于基因片段不大的蛋白可以考慮用幾個(gè)線性化位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化篩選，但是如果片段大，就有可能供選擇的機(jī)會(huì)少，而且也有可能遇上沒有合適的線性化位點(diǎn)的情況，這個(gè)時(shí)候也不是說不能進(jìn)行表達(dá)，但是準(zhǔn)備的質(zhì)粒就要增加10倍，另外也可以進(jìn)行部分酶切（即先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，掐定時(shí)間和酶量保證被切開的質(zhì)粒有部分是在線性化位點(diǎn)切開而基因片段保存完好）。LiCl轉(zhuǎn)化 取適量單鏈鮭精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上備用，取上述制備好的感受態(tài)細(xì)胞12000rpm，離心15s，吸棄LiCl溶液，按順序依次加入50%PEG 240ml1mmol/L LiCl 36 ml單鏈鮭精DNA 25ml線性化質(zhì)粒DNA 10 ml (約10mg)用吸頭反復(fù)吹打，使細(xì)胞沉淀與加入的溶液混勻，30℃靜置溫育30min，42℃熱擊2025min，4500rpm離心10min，吸棄轉(zhuǎn)化液，細(xì)胞沉淀加1mlYPD培養(yǎng)基于30℃ 200 rpm培養(yǎng)24hr，取轉(zhuǎn)化混合液100ml涂布含100181。建議PCR過程中使用多對(duì)引物進(jìn)行反應(yīng)，包括自己基因的，αfactor的，539。誘導(dǎo)物甲醇注意要在超凈臺(tái)中打開，可以分裝到滅過菌的瓶子中——當(dāng)然甲醇是不能滅菌的，而且也要注意在用酒精燈過甲醇瓶口的時(shí)候要小心，如果真的引起爆炸那可就損失大了。SDSPAGE的配置參見分子克隆，注意你的蛋白大小與膠的濃度的對(duì)應(yīng)性，如果小到20kD以下，可以考慮用tricine膠，不過是個(gè)需要全盤重新準(zhǔn)備的過程，要考慮清楚。但是為了避免對(duì)每一個(gè)表達(dá)菌株進(jìn)行繁瑣的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)，仍需摸索表達(dá)菌株的搖瓶培養(yǎng)條件，使其產(chǎn)物的表達(dá)量與預(yù)期的發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果相近。我的目的蛋白是一個(gè)大小為45kDa，可以通過二硫鍵形成反向平行二聚體（antiparallelhomodimer）的糖蛋白，經(jīng)過純化，我通過一個(gè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（cell proliferationassay）檢測(cè)了其活性，結(jié)果表明表達(dá)出來的蛋白在體外有完全的活性。另外為了防止蛋白在分泌出來的過程就降解了（特別是小分子蛋白），也可以通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值抑制蛋白水解酶的活性（這一方面說明書講解得詳細(xì)），還可以加入酪蛋白氨基酸等保護(hù)物質(zhì)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制蛋白水解酶的活性來防止表達(dá)產(chǎn)物降解。C培育過夜。leslie：完成轉(zhuǎn)化后就是克隆鑒定的過程了，包括高拷貝篩選，PCR鑒定和表型鑒定的過程，其中我做的比較多的是PCR鑒定（因?yàn)楸容^快），具體過程protocol上說的很清楚，其實(shí)也很簡(jiǎn)單，就是凍融破菌進(jìn)行菌落PCR，但是其中許多具體細(xì)節(jié)問題也挺讓人頭痛的，第一就是破壁的問題，許多人用PCR方法進(jìn)行鑒定都無法得到結(jié)果，甚至在表達(dá)出了以后還是無法得到這張鑒定圖片，主要原因之一就是無法正常釋放酵母基因組，一般通過培養(yǎng)菌然后進(jìn)行沸水和20℃冷凍循環(huán)過程裂解細(xì)胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以內(nèi)是可以得到好的結(jié)果的，但是有時(shí)候片段過長(zhǎng)，模壁就會(huì)阻礙擴(kuò)增，所以我們實(shí)驗(yàn)室會(huì)用蝸牛酶（很便宜的酶來的）來幫助溶菌，我看許多實(shí)驗(yàn)室也會(huì)這么做，不過加入的時(shí)間不同而已，其次也有奢侈的用試劑盒的。轉(zhuǎn)化方法有不少，例如電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，其方法的難易程度和轉(zhuǎn)化率高低呈反向遞減的，也就是說電轉(zhuǎn)最容易，轉(zhuǎn)化率較高（但要求有電轉(zhuǎn)儀），而原生質(zhì)體最麻煩，而且效果不好（比較傳統(tǒng)），因此不建議使用，EasySelect說明書上這么建議，并且也詳細(xì)說明了電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化（EasyComp和LiCl）方法的過程，可以按部就班。所以一般手冊(cè)都會(huì)建議同時(shí)在這幾種菌株中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這主要是因?yàn)椴煌幕蛟诓煌慕湍妇锌赡鼙磉_(dá)量截然不同，因此在最開始的時(shí)候建議多用幾種酵母菌實(shí)驗(yàn)。除此之外許多高A+T含量的基因通常會(huì)由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄，也需要多加注意。第一步——構(gòu)建載體Xiang Yang：pPICZ系列有許多克隆位點(diǎn)可供選擇，同時(shí)也有三種讀碼框以便不用的用戶需要。甲基酵母部分優(yōu)點(diǎn)與其他真核表達(dá)系統(tǒng)比較與原核表達(dá)系統(tǒng)比較，具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工，有利于真核蛋白的表達(dá)優(yōu)點(diǎn)+，外源基因產(chǎn)物表達(dá)量高，可以達(dá)到每升數(shù)克表達(dá)產(chǎn)物的水平++++、轉(zhuǎn)化、高密度發(fā)酵等操作接近原核生物，遠(yuǎn)較真核系統(tǒng)簡(jiǎn)單，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。也有一些人采用別的信號(hào)肽來克服這方面的問題。另外，可根據(jù)情況加入蛋白酶抑制劑。因此有關(guān)基因優(yōu)化的策略還希望有高人貢獻(xiàn)一下自己的心得或大家一起探索一些可能的策略。常見的優(yōu)化方式有密碼子優(yōu)化及發(fā)卡結(jié)構(gòu)消除。再加入 proteinase K (20mg/ml) , 在37℃孵育30分鐘。8） Eppendorf管中。但是這個(gè)方法很好用，不管是啤酒酵母，還是PICHIA，都沒有問題。我們不可能對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)化子都去比較它們的表達(dá)量，而且它們之間差距并不大，我覺得后面的條件優(yōu)化對(duì)表達(dá)量的影響更大。采用pyrimidine 兄弟推薦的畢赤酵母高效轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方案,稀釋200倍涂G418板子,在2~,上次每個(gè)MD板子上只長(zhǎng)了30個(gè)左右克隆,在在2~?在G418板子上長(zhǎng)出的克隆,大家都用什么辦法,簡(jiǎn)捷而又準(zhǔn)確地知道蛋白是否表達(dá)了呢?是否PCR鑒定正確的克隆,都能表達(dá)呢?,用western blot法,可以直接檢測(cè)電轉(zhuǎn)化后MD板上生長(zhǎng)出來的HIS+轉(zhuǎn)化子,方法就是在BMMY平板上,覆上NC膜(無菌),用牙簽將菌落點(diǎn)到膜上,培養(yǎng)幾天,期間往平板蓋上補(bǔ)加甲醇,因?yàn)槭堑怪玫?甲醇揮發(fā)可以補(bǔ)充培養(yǎng)里的甲醇消耗. 到時(shí)取出NC膜,檢測(cè),通過顯色圈位置與大小,就可初步判斷是否表達(dá)與表達(dá)量的多少.,就是沒有抗體可用的. 遇到上千個(gè)重組子要篩選的話,真的很頭疼,看到很多發(fā)表的文獻(xiàn)上,用G418濃度梯度,4mg/mL. 操作條件和檢測(cè)效果真的有這么理想么? ? ?假若1000個(gè)重組子里有一個(gè)是抗4mg/mL的多拷貝,其他都無抗性,這一個(gè)重組子也會(huì)增值,可能在每個(gè)濃度梯度的板上都會(huì)長(zhǎng),在4mg/mL的板上也可能會(huì)長(zhǎng)出好多個(gè),結(jié)果做花了這么多功夫,到底還是就那么一個(gè). (這是推測(cè)了,但可能就是事實(shí))所以當(dāng)你面對(duì) 幾千個(gè)MD板上長(zhǎng)出的HIS+轉(zhuǎn)化子時(shí), 是喜悅還是苦惱呢?!(除了Invitrogen手冊(cè)上,在96孔板里傳3代,使每個(gè)轉(zhuǎn)化子都達(dá)到相同的稀釋外),還有什么好方法能使每個(gè)轉(zhuǎn)化子的濃度均一? 或有什么更簡(jiǎn)便有效的方法?用G418濃度梯度,想把梯度放大,少做幾板,有什么經(jīng)驗(yàn)可以參考呀? 請(qǐng)教了對(duì)于樓上的，我也有相同的困惑。所以具體蛋白要具體分析。因?yàn)檎n題是以應(yīng)用為主的，必須為后面的高產(chǎn)著想。那我該如何估算我目的蛋白的表達(dá)量呢？我見過都是用SDSPAGE分析目的蛋白占上清總蛋白的比例阿，然后根據(jù)上清總蛋白推算。轉(zhuǎn)速啥的沒做過。搖瓶的問題我也說不出來，因?yàn)槲业侥壳盀橹苟紱]做出分泌性表達(dá)來