【正文】 是由一聯(lián)串的反應組成的，催化此物質(zhì)生成的第一步的酶，往往被它們終端產(chǎn)物抑制。這種抑制叫反饋抑制。（10） 多酶復合體：由幾種酶靠非共價鍵彼此嵌合而成。， AgNO3，求該酶的最低相對分子質(zhì)量。（Mr:92103）在最適條件下，試計算：（1）酶的比活力。[500U/mg]（2）轉(zhuǎn)換數(shù)。[]解：（1）比活力= （2）轉(zhuǎn)換數(shù)=1247。（1106/92103106）=，其轉(zhuǎn)換數(shù)為6104min1，試計算該酶在細胞內(nèi) 濃度（假設新鮮組織含水80%，并且全部在細胞內(nèi)）。[107 mol/L]解：1/610440247。（180%103）=[107 mol/L，其相對分子質(zhì)量為120103，由6個相同亞基組成。純酶的Vmax為2800U/mg酶。它的一個活力單位規(guī)定為：在標準測定條件下，37℃、15min內(nèi)水解10μmol焦磷酸所需要的酶量。問：（1）酶mg酶在每秒鐘內(nèi)水解多少mol 底物？[105mol]。（2）每mg酶中有多少mol的活性部位（假設每個亞基上有一個活性部位）？[5108mol活性中心]。（3）酶的轉(zhuǎn)換數(shù)是多少？[622s1或622mol焦磷酸/（smol）酶活性中心]解：（1）280010/151/（60106）1=105 mol （2）1103/1201036=5108 mol （3）105247。1103/1201031/6=622，以酪蛋白為底物，用Folin酚比色法測定酶活力，得知每小時產(chǎn)生1500μg酪氨酸。另取2ml酶液，若以每分鐘產(chǎn)生1μg 酪氨酸的酶量為1個活力單位計算，根據(jù)以上數(shù)據(jù)，求出：（1）1ml酶液中所含蛋白質(zhì)量及活力單位。[，250U]（2）比活力。[400U/mg蛋白質(zhì)]（3）1g酶制劑的總蛋白含量及總活力。[，105U]解：（1）247。（225/25）= 1500/60247。（25/25）=250U （2）250247。=400U/mg （3）247。（125/25）1103= 103mg= 1500/60247。（25/25）247。（125/25）103=105U，用水溶解成1000ml，從中取出1ml測定淀粉酶活力。計算每g酶制劑所含淀粉酶活力單位數(shù)？[3000U]（淀粉酶活力單位定義：在最適條件下每小時分解1g淀粉的酶量稱為1個活力單位）解：60247。（1/10001）=3000U，竟測定得到下列數(shù)據(jù)：試計算比活力、百分產(chǎn)量及純化倍數(shù)。[比活力：180U/mg蛋白質(zhì)，百分產(chǎn)量：17%，純化倍數(shù)：9倍]體積/ml活力單位/（U/ml）蛋白質(zhì)/（mg/ml）初提取液（NH4）2SO4鹽析1205200810104解：（1）810/=180U/mg （2）8105247。（200120）100%=17% （3）180247。（200/10）=9第九章 酶促反應動力學提要酶促反應動力學是研究酶促反應的速率以及影響此速率各種因素的科學。它是以化學動力學為基礎討論底物濃度、抑制劑、pH、溫度及激活劑等因素對酶反應速率的影響?；瘜W動力學中在研究化學反應速率與反應無濃度的關系時，常分為一級反應、二級反應及零級反應。研究證明，酶催化過正的第一步是生成酶底物中間產(chǎn)物，MichaelisMenten該呢舉中間產(chǎn)物學說的理論推導出酶反應動力學方程式，即Km、Vmax、kcat、kcat/Km。Km是酶的一個特征常數(shù)，以濃度為單位，Km有多種用途，通過直線作圖法可以得到Km及Vmax。Kcat稱為催化常數(shù)，又叫做轉(zhuǎn)換數(shù)（TN值），它的單位為s1，kcat值越大，表示酶的催化速率越高。kcat/Km常用來比較酶催化效率的參數(shù)。酶促反應除了單底物反應外，最常見的為雙底物反應，按其動力學機制分為序列反應和乒乓反應，用動力學直線作圖法可以區(qū)分。酶促反應速率常受抑制劑影響，根據(jù)抑制劑與酶的作用方式及抑制作用是否可逆，將抑制作用分為可逆抑制作用及不可逆抑制作用。根據(jù)可逆抑制劑與底物的關系分為競爭性抑制、非競爭性抑制及反競爭性抑制3類，可以分別推導出抑制作用的動力學方程。競爭性抑制可以通過增加底物濃度而解除，其動力學常數(shù)Kˊm變大，Vmax不變；非競爭性抑制Km不變，Vˊmax變?。环锤偁幮砸种芀ˊm及Vˊmax均變小。通過動力學作圖可以區(qū)分這3種類型的可逆抑制作用。可逆抑制劑中最重要的是競爭性抑制，過度態(tài)底物類似物為強有力的競爭性抑制劑。不可逆抑制劑中，最有意義的為專一性Ks型及kcat型不可逆抑制劑。研究酶的抑制作用是研究酶的結構與功能、酶的催化機制、闡明代謝途徑以及設計新藥物的重要手段。溫度、pH及激活劑都會對酶促反應速率產(chǎn)生重要影響，酶反應有最適溫度及最適pH，要選擇合適的激活劑。在研究酶促反應速率及測定酶的活力時，都應選擇酶的最適反應條件。習題%時，在Km和[S]之間有何關系？[Km=[S]]解：根據(jù)米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])得：=Vmax[S]/(Km+[S])Km=[S]102 mol/L，當?shù)孜镞^氧化氫濃度為100mol/L時，求在此濃度下，過氧化氫酶被底物所飽和的百分數(shù)。[80%]解：fES=[S]/（Km+[S]）=100103/(102+100103)=80%→P測得如下數(shù)據(jù)：[S]/molL1V/nmolL1min1106105104103102（1） 計算Km及Vmax。[Km：105，Vmax：75 nmolL1min1]（2） 當[S]= 5105 mol/L時，酶催化反應的速率是多少？[ nmolL1min1]（3） 若[S]= 5105 mol/L時，酶的濃度增加一倍，此時V是多少？[100 nmolL1min1]（4） 表中的V是根據(jù)保溫10min產(chǎn)物生成量計算出來的，證明V是真正的初速率。解：（1）由米氏方程得：15=Vmax106/ (Km+106)……① 60=Vmax104/（Km+104）……②由①、②得：Km=105，Vmax=75 nmolL1min1（2）V=755105/（105+5105）= nmolL1min1（3）502=100 nmolL1min1（4）帶如米氏方程可驗證。105 molL1，Vmax為22μmolL1 min1，底物濃度為2104 molL1。試計算：（1）競爭性抑制劑，（2）非競爭性抑制劑，（3）反競爭性抑制劑的濃度均為5104 molL1時的酶催化反映速率？這3中情況的Ki值都是3104 molL1，（4）上述3種情況下，抑制百分數(shù)是多少？[（1） min1，24%；（2） min1，%；（3） min1，%]解：（1）競爭性抑制劑的米氏方程為：V=Vmax[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S])代入數(shù)據(jù)得：V= min1i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=24%（2）非競爭性抑制劑的米氏方程為：V=Vmax[S]/((Km+[S])(1+[I]/Ki))代入數(shù)據(jù)得：V= min1i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=%（3）反競爭性抑制劑的米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S](1+[I]/Ki))代入數(shù)據(jù)得：V= min1i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=%6．今制得酶濃度相同、底物濃度不同的幾個反應混合液，并測得反應初速率，數(shù)據(jù)見下表。請利用“EadieHofstee”方程式，用圖解法求出Km值及Vmax值。這種作圖法與LineweaverBurk作圖法比較有何優(yōu)點？[Vmax=160μmolL1 min1,Km=105 molL1][S]/molL1V/μmolL1min11041301041101048910562105531053810532解：將米氏方程改寫成：V=VmaxKmV/[S],以VV/[S]作圖，得一直線，其縱截距為Vmax，斜率為Km，由圖得Vmax=160μmolL1min1,Km=105 molL1優(yōu)點：實驗點相對集中于直線上，Km和Vmax測定值較準確。，當?shù)孜餄舛萚S]=Km，競爭抑制劑濃度[I]=Ki時，反應的初速率是多少？[V=1/3Vmax]解：根據(jù)米氏方程可得：V=Vmax[S]/ (Km(1+[I]/Ki)+[S]),其中[S]=Km，[I]=KiV= VmaxKm/ (Km(1+Ki/Ki)+Km)=1/3 Vmax：（1）無抑制劑和有抑制劑的Vmax和Km值。[無抑制劑時Km=105 molL1，Vmax=50μmolL1min1，有抑制劑時：Km=105 molL1，Vmax=50μmolL1min1]（2）EI復合物的解理常數(shù)Ki。[Ki= 103molL1][S]/molL1V/μmolL1min1無抑制劑有抑制劑（103 molL1）105105105105105解：（1）無抑制劑時：V=Vmax[S]/(Km+[S])，將表中數(shù)據(jù)代入此式可得Km=105 molL1，Vmax= 對表中數(shù)據(jù)用V對[S]作圖，求Km值，可判斷有抑制劑時，Km值明顯增大，故該抑制劑應為競爭性抑制劑。據(jù)V=Vmax[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S])以及Vmax不變的性質(zhì)可得，此時Vmax=，Km=105 molL1，Ki= 103molL19．同上。，求出下列參數(shù)（反應混合物中酶量為103μmol）。（1）Km；（2）Vmax；（3）kcat/Km；(4)轉(zhuǎn)換數(shù)。[Km:5104molL1；Vmax:6μmolL1min1；kcat/Km: 2105 mol1Ls1；轉(zhuǎn)換數(shù):100s1]解：Vmax=kcat[Et]=k3[E]=k3[ES]？胰凝乳蛋白酶的轉(zhuǎn)換數(shù)100s1，DNA聚合酶是15s1。（1） 胰凝乳蛋白酶結合第五比DNA聚合酶有更高的親和性。（2） 胰凝乳蛋白酶反映速率比DNA聚合酶反映速率更大。（3） 在特別的酶濃度和飽和底物水平下胰凝乳蛋白酶反應速率比DNA聚合酶在相同條件下更低。（4） 在飽和底物水平下，兩種酶的反應速率。，它符合MichaelisMenten動力學，其Km為1106molL1。 molL1時。試問：底物濃度分別為102molL103molL1和106molL1時的反應初速率是多少？[1107 molL1min1，5108 molL1min1]解：∵Km=1106molL1《[S]= ∴V=Vmax=將題中數(shù)據(jù)代入米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])得：設[S]=xKmV=VmaxxKm/((x+1)Km)=x/(x+1)Vmax=1/(1+1/x)VmaxV1= V2= V3=1/2Vmax=13．假設2104 molL1的[I]抑制了一個酶催化反應的75%，計算這個非競爭性抑制劑的Ki？[105 molL1]解：i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=75% Vi/Vo=1/4 → Vo=4Vi……①再根據(jù)無抑制劑時的米氏方程：Vo=Vmax[S]/(Km+[S])……②加入非競爭性抑制劑時：V=Vˊmax[S]/((Km+[S])(1+[I]/Ki))……③，此時Vmax變小，Km不變。由①②③得：Ki=2104/（4Vˊmax/ Vmax1） Vˊmax = VmaxKi=105 molL1104 molL1 。Ki為2105mol/L。103mol/L時，要得到75%的抑制，需競爭性抑制劑的濃度是多少？[104mol/L]解：i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=75% Vi/Vo=1/4 → Vo=4Vi……①再根據(jù)無抑制劑時的米氏方程：Vo=Vmax[S]/(Km+[S])……②加入競爭性抑制劑時：V=Vˊmax[S]/(Kˊm(1+[I]/Ki) +[S])……③，此時Vmax變小，Km不變。由①②③得：[I]=4KmKi/KˊmKi+3[S][Ki]/Kˊm加入抑制劑時，Km=Kˊm ∴[I]= 104mol/L。什么是過度態(tài)底物類似物？它屬于何種類型抑制劑？答：Ks型抑制劑根據(jù)底物的化學結構設計，具有底物類似的結構，可以和相應的酶結合，同時還代有一個活潑的化學基團，能與酶分子中的必需基團反應進行化學修飾，從而抑制酶。因其專一性取決于抑制劑與活性部位必需基團在反應前形成非共價絡合物的解離常數(shù)以及非活性部位同類基團形成非共價絡合物的解離常數(shù)之比，即Ks比值，故這類抑制劑稱不可逆Ks抑制劑。例如：胰蛋白酶要求催化的底物具有一個帶正電荷的側(cè)鏈，如Lys、Arg側(cè)鏈。對甲苯磺酰L賴氨酰氯甲酮（TLCK）和胰蛋白酶活性部位必需集團His57共價結合，引起不可逆失活。Kcat型不可逆抑制劑具有天然底物的類似結構，其本身也是酶的底物，能與酶結合發(fā)生類似于底物的變化。但抑制劑還有一個潛伏的反應基團，當酶對它進行催化反應時，這個潛伏反映基團被暴露或活化，并作用于酶活性部位的必需基團或酶的輔基，使酶不可逆失活，其專一性極高。例如β鹵代DAla是細菌中丙氨酸消旋酶（AR）的不可逆抑制劑，屬于磷酸吡哆醛類的自殺性底物。過渡態(tài)底