【導(dǎo)讀】特殊染色技術(shù)理論及操作手冊。常規(guī)標(biāo)本制作程序。六、科學(xué)研究材料的取材。（三）固定的注意事項(xiàng)。（二）冷凍切片的目的。標(biāo)本的件數(shù)與申請單是否相符；標(biāo)本是否用固定液固定過。2，標(biāo)本經(jīng)上述驗(yàn)收后，進(jìn)行編號(hào)登記，以防錯(cuò)亂。檢的關(guān)鍵，通常把這過程稱為取材。①取出所有送檢的標(biāo)本，量其大小，稱其重量，描寫其色澤，質(zhì)地，形狀和。位等，必要時(shí)繪圖說明。④對于罕見特殊的標(biāo)本，應(yīng)小心保存好，在不影響診斷的情況下，盡量保存好大。以利于教學(xué)標(biāo)本，陳列標(biāo)本的收集。

　　

【正文】 在切片染色前，必須用碘除去汞鹽的沉著。應(yīng)用該固定液的組織，細(xì)胞核及細(xì)胞漿染色十分清晰，特別是要顯示骨骼肌的橫紋時(shí)，應(yīng)用本液可獲得滿意的結(jié)果，但由于其含有醋酸，故不能用于保存細(xì)胞顆粒，紅細(xì)胞及含鐵血黃素。 （ 2） Flemming 氏液 2%酸水溶液 200ml 1%鉻酸水溶液 700ml 冰醋酸 100ml 該液中的奧酸對脂肪組織既有固定作用，又有染色作用，對有髓神經(jīng)纖維也有固定兼染髓鞘的作用。如果做 HE 的染色，該液不適合。應(yīng)用該液固定的組織，切 21 片不能太大過厚， 一般 12 毫米厚固定時(shí)間 13 天，后經(jīng)水洗，保存于 80%酒精中，除上述兩液體外，還有 Bouin 氏液和 Carnoy 氏液等。冰醋酸也有許多不足之處： 不能作為單一的固定劑。冰醋酸在實(shí)際應(yīng)用中，常被作為添加劑來使用，如許多種固定液，都加入了冰醋酸。另外，在蘇木素和伊紅染液中，也常加入了冰醋酸。 不能凝固蛋白質(zhì)，不能保存白細(xì)胞顆粒，紅細(xì)胞及含血鐵黃素等。 價(jià)格較貴。 (4) 重鉻酸鉀是一種固體，粉末狀，桔紅色，具有毒 性，較難溶解于涼水，因此在配制時(shí)用較高溫度的水來溶解，也較易發(fā)生沉淀。它的優(yōu)點(diǎn)是： 能固定脂肪及類 脂物。 為髓鞘及嗜鉻細(xì)胞優(yōu)良的媒染劑。 可配成多種的混合固定液 （ 1） Helly 氏液 [7] 重鉻酸鉀 25g 升汞 50g 蒸餾水 1000ml 甲醛 50ml 臨用時(shí)加入甲醛，因其加入后于 24 小時(shí)后可發(fā)生沉淀而失效，因用時(shí)應(yīng)特別注意。 該液是白細(xì)胞顆粒的優(yōu)良固定劑，因此凡為白細(xì)胞或造血器官如骨髓，脾臟及患先天性梅毒之肝臟等，可用此液固定。 此液原配方要求加入硫酸鈉，但據(jù)我們經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，硫酸鈉在液中對組織無任何作用，故省去。 （ 2） Orth 氏液 重鉻酸鉀 20g 蒸餾水 1000ml 甲 醛 100ml 該液固定組織較緩慢，不適合于作臨床的活檢固定液， 4 毫米厚的組織固定時(shí)間需3672 小時(shí)，該液對于染色質(zhì)的固定好，顯示清晰，但可溶解部分紅細(xì)胞和含鐵血黃素。 重鉻酸鉀的不足之處有： 不能沉淀蛋白質(zhì)，它必須和醋酸配成混合固定液，方能發(fā)揮作用，產(chǎn)生鉻酸，沉淀蛋白質(zhì)。 具有毒性及產(chǎn)生高溫。在配制液體時(shí)，如清洗劑，當(dāng)加入硫酸時(shí)，可產(chǎn)生很高的溫度，并揮發(fā)出刺鼻的氣體，應(yīng)特別注意。 它不能長期固定組織，經(jīng)它固定的組織應(yīng)充分水洗后保存于 80%酒精中。 （六） 氯化汞又稱升汞，具有毒性。單獨(dú)用于固定 組織，對組織有較大的收縮力，故很少單獨(dú)使用。它可使組織蛋白凝固，迅速硬化而形成白色硬膜，這是由于它穿透力極弱所致，因此它不適合固定較厚的組織。它常與其它的試劑配成混合固定液，彼此抵消各自存在的不足，使固定組織的效果非常好。應(yīng)用升汞配成的固定液的優(yōu)點(diǎn)有： 細(xì)胞核及細(xì)胞漿染色清晰。 對白細(xì)胞顆粒，造血器官如骨髓和脾臟等是優(yōu)良的固定劑。 可配成許多混合固定液如： Zenker 氏、 Helly 氏和 Stieve 氏等。 22 它的不足之處是： 容易產(chǎn)生汞鹽沉淀。經(jīng)升汞配成的混合固定液固定的組織，一是不能固定太長時(shí)間，經(jīng) 24h 后沖 水，然后保存于 70%或 80%的酒精中，二是在洗色前，都必須用碘除去汞鹽的沉淀，以免由于汞鹽沉淀在切片上而影響對切片的觀察。 對組織有較大的收縮力且穿透力弱，用它不能固定過厚的組織，因穿透力弱，組織中間部分固定不好。 具有毒性。 （五）、微波輻射固定組織。 [8]－ [9] 組織固定的結(jié)果是組織中的蛋白質(zhì)凝固，以保存組織中原有的微細(xì)結(jié)構(gòu)。常規(guī)固定用的是甲醛或酒精等。但是這些固定劑從某些方面來說其穿透力不很強(qiáng)，因而需要較長時(shí)間的固定，另者，臨床上的冰凍切片，有的應(yīng)用快速加熱法預(yù)先固定組織，造成福爾馬林的極度揮發(fā)，污 染環(huán)境，影響人們的身體健康，因此尋找其它固定組織的方法就成為研究的重點(diǎn)。微波輻射固定組織，就是在這種情況下產(chǎn)生的。 微波是一種具有能量的電磁波，在其運(yùn)動(dòng)期間可產(chǎn)生瞬間熱。由于微波的快速運(yùn)動(dòng)，也導(dǎo)致了物體內(nèi)部極性分子的快速運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生了熱量，致使組織蛋白凝固，因此，舊的叫法稱微輻射固定組織。按實(shí)際的應(yīng)稱為微波輻射凝固蛋白。 組織固定溫度和時(shí)間的選擇。 究竟微波產(chǎn)生的熱量需要多高，才級(jí)使蛋白凝固的呢： Masson 氏等人的研究表明，70090℃，對沒有固定的蛋白可發(fā)生變性。 Bernard 經(jīng)過一系列的研究后認(rèn)為，肝 、腎、肺的最佳固定溫度是 70℃，和 77℃，因?yàn)楦鞣N組織的結(jié)構(gòu)不同，成分不一，電子密度不一樣，因而固定所需要的溫度也不樣。我們的實(shí)驗(yàn)認(rèn)為， 65℃左右的溫度可適合于各種組織，條件是固定取小塊材料，時(shí)間在截取 34min。 微波爐檔次的選擇 目前市售微波爐品種繁多，要選用合適的微波爐，必須根據(jù)各人的使用習(xí)慣和愛好。微波爐一般分為高火、中火及低火。使用時(shí)要進(jìn)行系列實(shí)驗(yàn)。例如多少 ml 的固定液需要多少時(shí)間達(dá)到多少溫度，用的是哪一檔次的火等。 微波輻射需固定液的選擇 張素娟等應(yīng)用臨床活檢新鮮組織如：甲狀腺、乳腺和淋巴結(jié)， 實(shí)驗(yàn)小鼠的腫瘤、肝臟、腎臟、心和肺等組織，分別用 10%的福爾馬林和生理鹽水經(jīng)微波輻射后，通過 HE、網(wǎng)染、 ABPAS 以及幾種抗體如 CEA、 EMA和 L26 等的檢測后發(fā)現(xiàn)，生理鹽水的結(jié)果最好。 一提固定，以往總與福爾馬林分不開，而經(jīng)微波輻射后的固定效果，竟然比前者好，這就解決了一大難題，即快速石蠟切片及冰凍切片的組織固定，以往用加熱固定的方法，其結(jié)果導(dǎo)致福爾馬林蒸發(fā)，使整個(gè)房間都充滿福爾馬林氣味，既污染了環(huán)境，也影響了身體的健康。雖然生理鹽水用微波輻射后對組織有良好的固定效果，但是它只能適合于少量的快速制片和某 些研究，絕不可能適合于大批量的活檢。因?yàn)榛顧z取材，現(xiàn)目前組織的制作，都基本上用機(jī)器來進(jìn)行，而所用的脫水盒，有銅和不銹剛的金屬物所制成，組織取材后，一個(gè)一個(gè)的盒子裝著組織，如果除去金屬來用微波固定，這是不現(xiàn)實(shí)的事情。另外，微波輻射，它的穿透力較弱，大量的組織塊，其中間是達(dá)不到要求的。 第四節(jié) 病理制片程序 一常規(guī)石蠟切片制片法 組織經(jīng)系列酒精的脫水，經(jīng)透明劑的作用，經(jīng)熔化的石蠟的浸漬，包埋后所切成的切片稱為石蠟切片。它適合于尸體解剖，臨床活檢和某些科研的切片。 23 （一） 組織脫水 把含于組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的水份用脫水劑把 其置換出來的過程稱組織脫水。不管是正常的組織，還是有病變的組織，都含有不同程度量的水分。據(jù)測定，人體的物質(zhì)組成約含水 55~67%，蛋白質(zhì) 15~18%，脂類 10~15%，無機(jī)鹽 3~4%及糖類 1~2%[14]。如果不把這些水分脫去，石蠟切片將無法進(jìn)行，因?yàn)槭灪退荒芑旌显谝黄穑猿ソM織中的水分成為制片中的關(guān)鍵，用什么物質(zhì)才能擔(dān)當(dāng)起這個(gè)重任呢，至今為止，國內(nèi)所用的都是酒精。因它不管在什么樣比例的情況下都能和水混合，所以它可以慢慢地將水從組織中置換出來。酒精脫水力強(qiáng)，對組織又有硬化和易脆的不良影響。在使用時(shí)， 通常是從低濃度至高濃度，濃度系列通常是 70%、 80%、 90%、 95%和 100%，組織經(jīng)過這一系列處理后，基本可達(dá)到脫水的目的。臨床上如使用含酒精的固定液固定組織時(shí)， (Carnoy 氏、 AAF 液 )組織不需要經(jīng)過低濃度的酒精，可直接進(jìn)入 95%酒精脫水。 組織脫水，目前常用的有兩種方法 人工組織脫水法 該法經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，靈活度高，可根據(jù)不同的組織及其大小來確定脫水時(shí)間，也可根據(jù)不同組織及大小分批進(jìn)行脫水，其優(yōu)點(diǎn)是： 可根據(jù)不同的組織及大小，任意增減脫水時(shí)間，達(dá)到脫水目的。 可隨時(shí)觀察組織的變化，隨時(shí)中斷組織的脫水，不使 組織過度硬脆。 可以多層次地進(jìn)行脫水。 缺點(diǎn) 需耗費(fèi)人力，每個(gè)步驟的遞增都需要人工完成。 不能大批量的進(jìn)行脫水。 必須在班上完成脫水或者定點(diǎn)于某一濃度的酒精中過夜，晚上無法進(jìn)行梯度遞增。 （ 2）、自動(dòng)組織脫水機(jī)脫水法 自動(dòng)組織脫水機(jī)的機(jī)型品種繁多，大小不一，國內(nèi)生產(chǎn)的軌道式和圓盤式兩種，國外生產(chǎn)的有圓盤式和柜式兩種，上述國內(nèi)外四種型號(hào)的機(jī)子，我們都使用過，根據(jù)使用的效果做一簡單介紹。 軌道式自動(dòng)組織脫水機(jī)。這種機(jī)子容量小，脫水用的試劑不足一升毫升，組織塊脫水用的提籃小，每次只能容納 40 塊組織左右，它適合于較 小的單位，但不適合于大單位。另外，該機(jī)在運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，裝試劑的蓋子打開，試劑容易揮發(fā)，污染環(huán)境，對人身體健康不利。 圓盤式自動(dòng)組織脫水機(jī)。國內(nèi)生產(chǎn)的這種機(jī)器容量也不夠大，每天處理組織塊，40 塊左右，如果大的病理科每天需要處理 150 塊左右組織塊時(shí)，需要這種機(jī)器4 臺(tái)左右。這種機(jī)器脫水時(shí)也屬于揭蓋式的，因此，試劑容易揮發(fā)，特別在夏天，必須經(jīng)常添加試劑，以補(bǔ)充被揮發(fā)去的試劑。這種機(jī)器，對環(huán)境同上述機(jī)器一樣。國外生產(chǎn)的也有同類產(chǎn)品。 全密閉柜式電腦控制自動(dòng)組織脫水機(jī)。 這種脫水機(jī)由電腦、反應(yīng)缸和試劑貯存缸三個(gè)部分組成，這三 部分可以分開使用，也可以結(jié)合在一起，形成一個(gè)柜式，一臺(tái)電腦可控制 5 臺(tái)脫水機(jī)。電腦功能包括時(shí)間、溫度和真空負(fù)壓等，可在小熒屏上顯示出來，同時(shí)可顯示正在進(jìn)行的脫水程序。根據(jù)需要，該機(jī)可編九套程序輸入電腦，我們的編程如下：第一套為正常室溫下脫水程序，該程序在換新試劑的幾天內(nèi)使用。第二套程序組織塊脫水不充分時(shí)啟動(dòng)使用，當(dāng)?shù)谌壮绦虻慕M織塊脫水不好時(shí)，則應(yīng)更換新液；第四套為周末程序，該套程序根據(jù)兩天 24 的休假時(shí)間，安排好組織塊的脫水時(shí)間。第五套為“八一”程序，第六套為“十一”程序，第七套為元旦程序，第八套為春節(jié)程序，這后 面幾套為節(jié)假日程序，根據(jù)節(jié)假日的放假時(shí)間不同，編排不同的程序。反應(yīng)缸內(nèi)在 15 秒左右的時(shí)間里抽入反應(yīng)所需的試劑，當(dāng)按程序表的時(shí)間反應(yīng)完畢后，在 15 秒左右的時(shí)間，將其送回貯存缸，然后則另換其它試劑，如此反復(fù)，直至整個(gè)程序完畢。試劑貯存箱內(nèi)由 12 個(gè)缸組成，每個(gè)缸的容量為 升。其中用于裝固定液的缸 1 個(gè)，裝酒精脫水劑的缸 7 個(gè)，裝透明劑的缸為 2 個(gè)，另有 2 個(gè)缸，一個(gè)裝二甲苯，當(dāng)石蠟在反應(yīng)缸中完成或浸蠟后，被送回蠟缸（在反應(yīng)缸的右邊）后，用以清除遺存的石蠟，還有一個(gè)缸裝無水酒精，用以清除遺存的石蠟，還有一個(gè)缸裝有無水 酒精，用以清除二甲苯的殘存液。 根據(jù)我們對各種不同的脫水機(jī)的應(yīng)用比較，認(rèn)為這種脫水機(jī)有以下特點(diǎn)： 該機(jī)容量大，每次可處理組織塊 250300 塊，這對于大、中等醫(yī)院的病理科較合適。 全部密閉，所有的試劑都由管道輸送。這樣一是保證了試劑不揮發(fā)，尤其是夏天，室溫較高，試劑揮發(fā)快，如為揭蓋式的脫水機(jī)，試劑揮發(fā)的程度無法形容，幾乎每天都必須添加，這樣試劑用量大，二是對環(huán)境污染不明顯，保證了舒適的工作環(huán)境。 帶有定期的攪動(dòng)裝置，如此可使組織固定均勻，脫水徹底。 整個(gè)過程過置于真空負(fù)壓的條件下來進(jìn)行，尤其是浸蠟，可節(jié)省 1/3 以上的時(shí)間，浸蠟充分徹底，尤其是對多孔的組織如肺組織，效果更明顯。 脫水機(jī)脫水的優(yōu)點(diǎn)有： 組織脫水均勻； 能在無人在的情況下完成組織的梯度遞增，完成脫水，透明和浸蠟程序，如此可節(jié)省人力物力。 能大批量地處理標(biāo)本。 脫水機(jī)脫水存在的不足： 由于機(jī)子的的原因，在脫水時(shí)，大小組織一窩煮，造成小組織過度處理而產(chǎn)生硬脆的現(xiàn)象，使之難以切成佳片。 如為揭蓋式的脫水機(jī)，液體容易揮發(fā)，污染環(huán)境，影響工作條件。 （二）組織的透明 組織經(jīng)過一系列酒精的處理后，雖然組織里所含有的水分已基本上被脫去，但是組織脫水時(shí)機(jī)里可殘留著 許多酒精，如果不將其去除掉，必然影響組織的進(jìn)一步處理，酒精不能溶解石蠟，必須尋找一種既能與酒精混合，又能溶解石蠟的試劑，方能使石蠟浸入到組織中去，這類物質(zhì)被稱為透明劑。它們是二甲苯、苯、三氯甲烷（氯仿）、香柏油、苯酚、松節(jié)油和汽油等。雖然透明劑種類多，但根據(jù)性能及效果看，還是二甲苯為最好。 二甲苯是一種透明無色的液體，揮發(fā)性強(qiáng)，打開后即可聞其味道，能溶解石蠟，能溶于酒精及丙酮等，但不能溶于水，它是一種良好的透明劑，組織經(jīng)充分脫水后放入該試劑，視組織的大小、種類的不同，確定不同的時(shí)間，便能達(dá)到透明目的。在一般 的情況下，胃、腸粘膜透明時(shí)間 510 分鐘，鼻咽部及排出物為 1520 分鐘左右，子宮肌瘤、平滑肌組織為 60120 分鐘。總之組織的透明，應(yīng)視組織的大小而定，不能千篇一律，要經(jīng)常觀察組織的透明情況，組織一經(jīng)透明，就必須從二甲苯中取出。因?yàn)槎妆綄M織的硬化程度特強(qiáng)，如果在其放置過長，就會(huì)引起組織的硬脆，難切片。如果組織在二甲苯放置到一定時(shí)間后，仍沒有達(dá)到透明，組織塊中間可出現(xiàn)粉白色的現(xiàn)象，這說明組織沒有完全脫水，處理這種情況有兩種方法，一是將其重新放入酒精 25 脫水，然后再透明，這種方法處理的組織很硬，切片較難。另 一種方法就是重取材。如果將沒脫水好的組織繼續(xù)做下去，切片將不完整?；蛘邿o法切片。 二甲苯及苯類物質(zhì)被認(rèn)為是一種致癌性的物質(zhì)，許多單位和個(gè)人都不敢用或盡量少用，或者在切片染色至酒精后，將切吹干就進(jìn)行封片，這種做法是非常糟糕的，