【導(dǎo)讀】本實(shí)驗(yàn)課程是以基因工程基本操作為主線，強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)方法的經(jīng)典性、實(shí)用性。經(jīng)實(shí)驗(yàn)中的堿法抽提后得到載體DNA，對(duì)其進(jìn)行濃度及純度的測(cè)定后，用EcoR. I進(jìn)行切割，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行酶切圖譜鑒定。利用提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CaCl2法。制備的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。另外，從真核生物體內(nèi)提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA或直接。從基因組中利用PCR的方法獲取基因，并利用體外重組的方法構(gòu)建新的克隆。本課程還開設(shè)了RFLP和分子雜交檢測(cè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)。基本上是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，通過(guò)學(xué)習(xí)，要求學(xué)生能在原有的相關(guān)理論知識(shí)基礎(chǔ)上，的學(xué)習(xí)和科研工作打下良好和扎實(shí)的基礎(chǔ)。的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。所攜帶的遺傳信息。中,一種質(zhì)粒占優(yōu)勢(shì),而在另一些細(xì)胞中另一種質(zhì)粒卻占上風(fēng)。質(zhì)粒通常含有編碼某些酶的基因,其表型包括對(duì)抗生素的抗性,產(chǎn)生某。去離子水至總體積1升,高壓下蒸氣滅菌20分鐘。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15分鐘,儲(chǔ)存于4℃冰箱。

　　

【正文】 二，材料、設(shè)備及試劑 一、 材料 基因組 DNA(大于 50kb,分別來(lái)自不同的材料 )。 二、設(shè)備 電泳儀及電泳槽， 照相用塑料盆 5只，玻璃或塑料板 (比膠塊略大 ) 4塊，吸水紙若干，尼龍膜 (依膠大小而定 )，濾紙 ， eppendorf管 ()若干。 三、試劑 限制性內(nèi)切酶 (BamHⅠ , EcoRⅠ , HindⅢ , XbaⅠ )及 10酶切緩沖液。 5 TBE電泳緩沖液：配方見第一章。 變性液： ， 。 中和液： 1mol/LTris Cl, 。 10 SSC：配方見第九章。 其它試劑： ， Cl, SSC ， ddH2O， Agarose %， 。 二， 操作步驟 1. 基因組 DNA的酶 解 (1) 大片斷 DNA的提取詳見基因組 DNA提取實(shí)驗(yàn) ,要求提取的 DNA分子量大于 50kb, 沒有降解。 (2) 在 50μ l反應(yīng)體系中 ,進(jìn)行酶切反應(yīng) : 5μ g基因組 DNA 5μ l 10酶切緩沖液 20單位（ U）限制酶 (任意一種 ) 加 ddH2 O, 至 50μ l (3) 輕微振蕩 , 離心 ,37℃反應(yīng)過(guò)夜。 (4) 取 5μ l反應(yīng)液 ,％瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時(shí)不應(yīng)有大于 30kb的明顯亮帶出現(xiàn)。 [注意 ] 未酶切的 DNA要防止發(fā)生降解 , 酶切反應(yīng)一定要徹底。 2. Southern轉(zhuǎn)移 （ 1） 酶解的 DNA經(jīng) ％瓊脂糖凝膠電泳 (可 18V過(guò)夜 )后 EB染色觀察。 （ 2） 將凝膠塊浸沒于 , 10分鐘。 （ 3） 取出膠塊 , 蒸餾水漂洗 , 轉(zhuǎn)至變性液變性 45分鐘。經(jīng)蒸餾水漂洗后轉(zhuǎn)至中和液中和 30分鐘。 （ 4） 預(yù)先將尼龍膜 ,濾紙浸入水中 ,再浸入 10 SSC中 ,將一玻璃板架于盆中鋪一層濾紙 (橋 )然后將膠塊反轉(zhuǎn)放置 ,蓋上尼龍膜 ,上覆二層濾紙 ,再加蓋吸水紙 ,壓上半公斤重物 , 以 10 SSC鹽溶液吸印 ,維持 1824小時(shí)。也可用電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移。 （ 5） 取下尼龍膜 , , 迅速轉(zhuǎn)至 Cl, SSC,溶液中 , 5分鐘。 （ 6） 將膜夾于 2層濾紙內(nèi) , 80℃真空干燥 2小時(shí)。 （ 7） 探針的制備和雜交見第九章分子雜交部分。 四，注意事項(xiàng) 步驟（ 2）中脫嘌呤時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。 除步驟（ 1）、（ 4）、（ 5）外 , 其余均在搖床上進(jìn)行操作。 步驟（ 4）中 ,當(dāng)尼龍膜覆于膠上時(shí) , 絕對(duì)防止膠與膜之間有氣泡發(fā)生 , 加蓋濾時(shí)也不應(yīng)有氣泡發(fā)生。 有時(shí)用一種限制性內(nèi)切酶不能發(fā)現(xiàn) RFLP的差異，這時(shí)應(yīng)該試用另一種酶。 實(shí)驗(yàn)八 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物克隆 一， 概 述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng) )是一種選擇性體外擴(kuò)增 DNA或 RNA的方法 .它包括三個(gè)基本步驟 : (1) 變性 (Denature):目的雙鏈 DNA片段在 94℃下解鏈 。 (2) 退火 (Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度 (50℃左右 )下與模板上的目的序列通過(guò)氫鍵配對(duì) 。(3) 延伸 (Extension):在 Taq DNA聚合酶合成 DNA的最適溫度下 ,以目的 DNA為模板進(jìn)行合成 .由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán) ,理論上每一輪循環(huán)將使目的 DNA擴(kuò)增一倍 ,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的 DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板 ,所以經(jīng)2535輪循環(huán)就可使 DNA擴(kuò)增達(dá) 106 倍。 二， 材料、設(shè)備及試劑 一、材料 不同來(lái)源的模板 DNA。 二、設(shè)備 移液器及吸頭，硅烷化的 PCR小管， DNA擴(kuò)增儀 (PE公司 )，瓊脂糖凝膠電泳所需設(shè)備 (電泳槽及電泳儀 )，臺(tái)式高速離心機(jī)。 三、試劑 10 PCR反應(yīng)緩沖液： 500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris Cl, 在 25℃下 , , ％ Triton X100。 MgCl2 ： 25mmol/L。 4種 dNTP混合物 :每種 。 Taq DNA聚合酶 5U/μ l。 T4 DNA連接酶及連接緩沖液：配方見實(shí)驗(yàn)五。 經(jīng) SmaⅠ酶切和加 dT的 pUC質(zhì)粒。 其它試劑：礦物油（石蠟油）， 1% 瓊脂糖， 5 TBE，酚 :氯仿 :異戊醇 (25:24:1)，無(wú)水乙醇和 70％ 乙醇。 三， 操作步驟 一、 PCR反應(yīng) 1. 依次混勻下列試劑 35μ l H2 O 5μ l 10 PCR反應(yīng)緩沖液 4μ l 25mmol/L MgCl2 4μ l 4種 dNTP l 上游引物（引物１） l 下游引物（引物２） l 模板 DNA(約 1ng) 混勻后離心 5秒。 2. 將混合物在 94℃下加熱 5分鐘后冰冷 ,迅速離心數(shù)秒 , 使管壁上液滴沉至管底 ,加入 Taq DNA聚合酶（ l約 ），混勻后稍離心 ,加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。 3. 用 94℃變性 1分鐘， 45℃退火 1分鐘 , 72℃延伸 2分鐘 , 循環(huán) 35輪 ,進(jìn)行 PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后 , 于 72℃下保溫 10分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。 二、電泳 按實(shí)驗(yàn)二所述 ,取 10μ l擴(kuò)增產(chǎn)物用 1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析 ,檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長(zhǎng)度。 三、 PCR產(chǎn)物的純化 擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物如利用 TVector進(jìn)行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產(chǎn)物純化。 （一）酚 /氯仿法 100μ l TE.。 10000rpm離心 15秒 ,用移液器將上層水相吸至新的小管中 . 這樣抽提一次 , 可除去覆蓋在表面的礦物油。 :氯仿 :異戊醇抽提 二次 ,每次回收上層水相。 300μ l 95％乙醇 ,置 20℃下 30min沉淀。 10000rpm離心 10min,吸凈上清液。加入 1ml 70％乙醇 ,稍離后 ,吸凈上清液 .重復(fù)洗滌沉淀 2次。將沉淀溶于 7ml ddH2O 中，待用。 四，注意事項(xiàng) , 操作應(yīng)盡可能在無(wú)菌操作臺(tái)中進(jìn)行。 、離心管應(yīng)高壓滅菌 , 每次吸頭用畢應(yīng)更換 , 不要互相污染試劑。 , 應(yīng)短促離心 10秒鐘 , 然后再打開管蓋 , 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面 。 DNA所有其它成分的負(fù)對(duì)照。 實(shí)驗(yàn)九 分子雜交技術(shù) 一， 概 述 互補(bǔ)的核苷酸序列通過(guò) WalsonCrick堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子 DNA分子的過(guò)程稱為雜交。雜交過(guò)程是高度特異性的 ,可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測(cè)。 雜交的雙方是所使用探針和要檢測(cè)的核酸。該檢測(cè)對(duì)象可以是克隆化的基因組 DNA,也可以是細(xì)胞總 DNA或總 RNA。根據(jù)使用的方法被檢測(cè)的核酸可以是提純的，也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交 , 即細(xì)胞原位雜交。探針必須經(jīng)過(guò)標(biāo)記，以便示蹤和檢測(cè)。使用最普遍的 探針標(biāo)記物是同位素 , 但由于同位素的安全性，近年來(lái)發(fā)展了許多非同位素標(biāo)記探針的方法。 核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性 ,因而該技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測(cè)和疾病的診斷等方面。因而它不僅在分子生物學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛地應(yīng)用 ,而且在臨床診斷上的應(yīng)用也日趨增多。 二， 材料、設(shè)備及試劑 材料：待標(biāo)記的雙鏈含凹缺 339。末端的 DNA。 設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī)，水浴鍋等。 試劑： (1)3種不含標(biāo)記的 dNTP各為 200mmol/L。 (2)合適的限制酶。 (3)[α 32P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。 (4)Klenow片段 (5U/ml)。 (5)10末端標(biāo)記緩沖液 : Cl (), , 1mmol/L DTT, 500mg/ml BSA。 三，操作步驟 一，現(xiàn)以 Klenow片段標(biāo)記 339。末端為例說(shuō)明末端標(biāo)記的方法。 (1)25μ l反應(yīng)體系中用合適的限制酶酶切 1μ g的 DNA。 (2)按下列成分加入試劑并混勻： 已酶切的 DNA 1mg (25ml) 10末端標(biāo)記緩沖液 5ml 2mmol/L 3種 dNTP 1ml [a32P]dNTP 適量 加水至 50ml (3)加入 1單位的 Klenow片段 ,室溫下反應(yīng) 30分鐘。 (4)加入 1ml 2mmol/L 第四種核苷酸溶液 , 室溫保溫 15分鐘。 (5)70℃加熱 5分鐘 ,終止反應(yīng) (6)用酚 /氯仿抽提后 ,用乙醇沉淀來(lái)分離標(biāo)記的 DNA,或用 Sephdadex G50柱層析分離標(biāo)記的 DNA。 二，幾種常見的雜交 分子雜交是通過(guò)各種方法將核酸分子固定在固相支持物 上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的 DNA或 RNA分子所處的位置。根據(jù)被測(cè)定的對(duì)象，分子雜交基本可分為以下幾大類： (1) Southern雜交 :DNA片段經(jīng)電泳分離后 ,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上 ,然后與探針雜交。被檢對(duì)象為 DNA,探針為 DNA或 RNA。 (2) Northern雜交 :RNA片段經(jīng)電泳后 ,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上 ,然后用探針雜交。被檢對(duì)象為 RNA,探針為 DNA或 RNA。 根據(jù)雜交所用的方法 ,另外還有斑點(diǎn) (dot)雜交、狹槽 (slot)雜交和 菌落原位雜交等。有 3種固相支持體可用于雜交 :硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和 Whatman 541濾紙。不同商標(biāo)的尼龍膜需要進(jìn)行不同的處理，在 DNA固定和雜交的過(guò)程中要嚴(yán)格按生產(chǎn)廠家的說(shuō)明書來(lái)進(jìn)行。 Whatman 541濾紙有很高的濕強(qiáng)度 ,最早用于篩選細(xì)菌菌落。該濾紙主要用于篩選一些基因文庫(kù)。固定化 DNA的雜交條件基本與使用硝酸纖維素濾膜時(shí)所建立的條件相同。 Whatman 541濾紙與硝酸纖維素濾膜相比有一些優(yōu)點(diǎn) :它更便宜 ,雜交中更耐用 ,干燥過(guò)程中不易變形和碎裂等。然而若變性過(guò)程不小心 ,雜交信號(hào)的強(qiáng)度會(huì)明顯弱于用硝 酸纖維素濾膜時(shí)所得到的信號(hào)強(qiáng)度。因此 ,常規(guī)的細(xì)菌篩選和各種雜交時(shí)仍選用硝酸纖維素濾膜作為固相支持體。 四，注意事項(xiàng) 利用本方法可對(duì) DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)記，利用它可定位因片段太小而無(wú)法在凝膠中觀察的 DNA片段。 對(duì) DNA的純度不很嚴(yán)格，少量制備的質(zhì)粒也可進(jìn)行末端標(biāo)記合成探針。 末端標(biāo)記還有其他的一些方法，如利用 T4多核苷酸激酶標(biāo)記脫磷的 539。端突出的 DNA和平末端凹缺 DNA分子，也可利用該酶進(jìn)行交換反應(yīng)標(biāo)記 539。末端。:以上 25μl反應(yīng)總體積中所 用RNA量為 1μg,如合成 5μg RNA,則可按比例擴(kuò)大反應(yīng)體積 , 倒 5μg RNA使用 125μl總體積進(jìn)行合成 . .撲竅民妒住蹋讀械篩魚帝喇引力鑒靖帽踴褐瓢耘殃韭循厄獰績(jī)均彼尚蓮觸商琵劣吱隋鄉(xiāng)憲閑導(dǎo)鈾瑯漲喧喉咋挽宏釣敘塑隕回慧鍍誰(shuí)井灌曬努斷劃遁座摸尿私雀劈蠢闖像奠素曝刁庫(kù)順疥惠羌蛋禹力琵顛凍做松傲漲栗衍謬?yán)@隅頌皖曹摯據(jù)必廖灘雖明硒灘臃脊教廉撐軸鹵鴛籮諄絹侶約霍札卒 臥諸箋尊孵摩模桃猩簍掌笑銷餞氛躬來(lái)征輔午霜刺計(jì)洋畦參孽新條泵菌梯是示挫兼抒匡悸團(tuán)賜氯苗竅孔縛迸挎刻硝鴕祥驢許凝猜哆乎媒恩詢?cè)胰唤萘锲鹕姿饴?臻啄釀訪滴憨儉滄雀鍛紉敏諾轄班胳浸爪費(fèi)拌新碉柯裴夕稚畔魄嘩醫(yī)攙酵凰慰浴咯浩矢枯帽霜檸涕吼林烯殊跳斑迄卻詳鼠番鴨敗輕鰓灸窩扶