【正文】 性氨基酸（特別是精氨酸）含量較為豐富，它們分散于不帶電荷的氨基酸序列之間；缺少帶負(fù)電荷的酸性氨基酸；羥基氨基酸（特別是絲氨酸）含量較高；有形成兩親（既有親水又有疏水部分）α螺旋結(jié)構(gòu)的能力。葉綠體蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)葉綠體定位信號(hào)肽一般有兩個(gè)部分，第一部分決定該蛋白質(zhì)能否進(jìn)入葉綠體基質(zhì)，第二部分決定該蛋白能否進(jìn)入類囊體。在這一模型中，蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)是在翻譯后進(jìn)行的，在運(yùn)轉(zhuǎn)過程中沒有蛋白質(zhì)的合成。葉綠體蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)過程有如下特點(diǎn)：①活性蛋白水解酶位于葉綠體基質(zhì)內(nèi)，這是鑒別翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)的指標(biāo)之一。②葉綠體膜能夠特異地與葉綠體蛋白的前體結(jié)合。③葉綠體蛋白質(zhì)前體內(nèi)可降解序列因植物和蛋白質(zhì)種類不同而表現(xiàn)出明顯的差異。 核定位蛋白的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制核定位序列（NLS—Nuclear Localization Sequence） NLS可以位于核蛋白的任何部位。蛋白質(zhì)向核內(nèi)運(yùn)輸過程需要一系列循環(huán)于核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)的蛋白因子包括核運(yùn)轉(zhuǎn)因子（Importin）α、β和一個(gè)低分子量GTP酶（Ran）參與。由上述三個(gè)蛋白組成的復(fù)合物?？吭诤丝滋?，依靠Ran GTP酶水解GTP提供的能量進(jìn)入細(xì)胞核，α和β亞基解離，核蛋白與α亞基解離，α和β分別通過核孔復(fù)合體回到細(xì)胞質(zhì)中，起始新一輪蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)。細(xì)菌同樣能通過定位于蛋白質(zhì)N端的信號(hào)肽將新合成的多肽運(yùn)轉(zhuǎn)到其內(nèi)膜、外膜、雙層膜之間或細(xì)胞外等不同部位。 蛋白質(zhì)的降解在大腸桿菌中，蛋白質(zhì)的降解是通過一個(gè)依賴于ATP的蛋白酶（稱為Lon）來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)細(xì)胞中出現(xiàn)錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)或半衰期很短的蛋白質(zhì)時(shí)，該酶就被激活。Lon蛋白酶每切除一個(gè)肽鍵要消耗兩個(gè)分子的ATP。成熟蛋白N端的第一個(gè)氨基酸（除已被切除的N端甲硫氨酸之外，但包括翻譯后修飾產(chǎn)物）在蛋白的降解中有著舉足輕重的影響（表416）。當(dāng)某個(gè)蛋白質(zhì)的N端是甲硫氨酸、甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸時(shí)，表現(xiàn)穩(wěn)定。其N端為賴氨酸、精氨酸時(shí)，表現(xiàn)最不穩(wěn)定，平均23分鐘就被降解了。在真核生物中，蛋白質(zhì)的降解依賴于泛蛋白（Ubiquitin），該蛋白只有76個(gè)氨基酸殘基，序列高度保守（從酵母和人細(xì)胞中提取的泛蛋白幾乎完全相同?。锛?xì)胞內(nèi)即將被降解的蛋白首先在ATP的作用下與泛蛋白相連。這個(gè)過程需有EEE3三個(gè)降解因子參與。一旦被降解蛋白與泛蛋白相連接，這個(gè)復(fù)合體就能被運(yùn)送到分子量高達(dá)1106的蛋白降解體系中直到完全降解。習(xí)題: : ,下列哪項(xiàng)是錯(cuò)誤的:,能識(shí)別mRNA分子的密碼 ? ’末端的帽子結(jié)構(gòu) : ?(放線菌酮) ,這些信號(hào)肽的長度是多少個(gè)氨基酸殘基: (signal recognition particle)的作用: 5 分子生物學(xué)研究法現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步使分子生物學(xué)研究在上世紀(jì)中葉開始高速發(fā)展。 重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件上世紀(jì)分子生物學(xué)研究取得的三大成就：第一，在20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者：即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；第二，50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制，解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；第三，50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動(dòng)與表達(dá)機(jī)制。40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；Hershey和Chase（1952）的噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)2. 50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半 保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；3. 50年代末至60年代，相繼提出了中心法則和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。但是：當(dāng)時(shí)由于缺乏有效的分離和富集單一DNA分子的技術(shù)，科學(xué)家無法對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行直接的生化分析。隨著DNA分子體外切割與連接技術(shù)及核苷酸序列分析技術(shù)的進(jìn)步直接推動(dòng)了重組DNA技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展。重組DNA技術(shù)（rebination）： 是應(yīng)用酶學(xué)方法，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代DNA分子的過程。工具酶： 限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease） DNA連接酶（DNA ligase）工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用是現(xiàn)代生物工程技術(shù)史最重要的事件兩大技術(shù)保證：重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶酶類功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)DNA片段連接成一個(gè)DNA分子DNA聚合酶I（大腸桿菌）按539。到339。方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的539。OH末端（進(jìn)行末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)或用來進(jìn)行DNA的連接末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的339。末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈的339。末端逐個(gè)切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的539。末端逐個(gè)切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈539?；?39。末端的磷酸基團(tuán)DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學(xué)和生物化學(xué)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)站起來的一門重要的DNA技術(shù)學(xué)，這門技術(shù)，對(duì)于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及克隆DNA片斷的操作，都有著十分廣泛的使用價(jià)值。重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶分子生物學(xué)研究的核心技術(shù) 基因操作（gene manipulation）：DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等?；蚬こ蹋╣ene engineering）：在體外將核酸分子接入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)而能持續(xù)的繁殖。 DNA操作技術(shù) 核酸的凝膠電泳v 電泳的基本原理：一種帶電粒子在電場中，會(huì)以一定的速度移向與它自身帶相反電荷的電極。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。v 核酸的凝膠電泳：糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈負(fù)電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。v 影響遷移率的四大因素:一、分子物理性質(zhì)：分子大?。捍蟮倪w移快電荷多少：電荷密度大的遷移快構(gòu)形：閉環(huán)(CCC)單鏈開環(huán)(OC) 線性(L)二、支持介質(zhì)：在電泳中常用無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，如瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠等，其分子的遷移率與分子的摩擦系數(shù)成反比。其中，摩擦系數(shù)與凝膠密度相關(guān)。三、電場強(qiáng)度：電泳場兩極間單位支持物長度的電壓降即為電場強(qiáng)度或電壓梯度。在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移率與所用電壓成正比。但當(dāng)電壓增高時(shí)，大分子量DNA片段遷移率的增大是不同的，因此瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨電壓增大而減小。電場強(qiáng)度愈大，帶電顆粒的泳動(dòng)速度愈快。四、緩沖液離子強(qiáng)度：緩沖液是電泳場中的導(dǎo)體，它的種類、pH值、離子濃度直接影響電泳的效率。常用的緩沖體系有Tris醋酸（TAE）、 Tris硼酸（ TBE ）、 Tris磷酸（ TPE ）三種。以TAE最為常用，價(jià)格低且其緩沖能力低，需經(jīng)常更新脈沖電場凝膠電泳（pulsedfield gel electrophoresis，簡稱PFGE）:用于分離超大分子量（甚至是整條染色體）DNA。在標(biāo)準(zhǔn)的PFGE中，第一個(gè)脈沖的電場方向與核酸移動(dòng)方向成45176。夾角，而第二個(gè)脈沖的電場方向與核酸移動(dòng)方向在另一側(cè)成45176。夾角 。應(yīng)用脈沖電場凝膠電泳技術(shù)，可成功地分離到分子量高達(dá)107bp的DNA大分子。核酸電泳的指示劑:電泳過程中，常使用一種有顏色的標(biāo)記物以指示樣品的遷移過程。核酸電泳常用的指示劑有兩種：溴酚藍(lán)呈藍(lán)紫色，二甲苯青呈藍(lán)色。溴酚藍(lán)的分子量為670Da，在不同濃度凝膠中，遷移速度基本相同，它的分子篩效應(yīng)小，近似于自由電泳，故被普遍用作指示劑。，攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠電泳中，遷移率比溴酚藍(lán)慢。核酸電泳的染色劑:溴化乙錠（EB）是一種具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相鄰堿基之間，并在300nm波長的紫外光照射下發(fā)出熒光。溴化乙錠不能與瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠相結(jié)合。在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下（ ug/ml），熒光強(qiáng)度與DNA片段的大?。ɑ驍?shù)量）成正比。 核酸的分子雜交定義：核酸雜交（Nucleic acid hybridization）：是指具有一定同源性的兩條單鏈核酸在一定條件下，按堿基互補(bǔ)的原則重新配對(duì)形成雙鏈的過程。原理：DNA的變性和復(fù)性在一定的條件（如適當(dāng)?shù)臏囟取⒂袡C(jī)溶劑存在等）下，DNA的雙鏈可解開成為單鏈，這一過程稱為DNA的變性（Denaturation）。高溫、低鹽和有機(jī)溶劑促進(jìn)DNA變性。DNA的雜交即復(fù)性（Renaturation）是變性的單鏈DNA在一定的條件下（低于Tm的溫度下）與其互補(bǔ)序列退火形成雙鏈的過程，因此雜交與Tm值相關(guān)。影響雜交的主要因素：溫度：一般在低于Tm約15至25度的溫度雜交速率最快。鹽濃度：鈉離子增加雜交分子的穩(wěn)定性，降低鈉離子濃度強(qiáng)烈地影響Tm值和復(fù)性速率。，對(duì)復(fù)性速度和Tm值影響不大。甲酰胺：有機(jī)溶劑如甲酰胺能減少雙鏈核酸的穩(wěn)定性。每增加1%的甲酰胺，DNA/DNA或DNA/℃。常用50%甲酰胺。硫酸葡聚糖：使雜交速率增加，但有時(shí)可能增加雜交本底。核酸探針的類型1 克隆的DNA片段，常用cDNA探針。2 RNA探針（Riboprobe）RNA探針的優(yōu)點(diǎn)是特異性高；雜交效率(靈敏度)更高。適合于Northen雜交、原位雜交等。主要缺點(diǎn)是不穩(wěn)定，易被降解，另外其制備較困難。3 寡核苷酸探針可用化學(xué)方法人工合成，制備較方便，但靈敏度稍差。4 聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物是很好的探針來源，其優(yōu)點(diǎn)是制備和標(biāo)記相對(duì)容易。核酸標(biāo)記的類型：放射性同位素：32P, 35S , 33P；目前應(yīng)用最廣，優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，特別適用于單拷貝基因或低豐度mRNA檢測，缺點(diǎn)是易造成放射性污染以及半衰期短，使用不便。非同位素標(biāo)記：常用地高辛或生物素系統(tǒng)。優(yōu)點(diǎn)：無放射性污染，較穩(wěn)定；缺點(diǎn)：靈敏度、特異性稍差。常用核酸雜交技術(shù)：濾膜雜交、固相雜交、原位雜交、核酸雜交、液相雜交。濾膜雜交：是指先將待檢測的核酸序列結(jié)合到適當(dāng)?shù)墓滔嘀С治锶缒猃埬ど希缓笈c存在于溶液中的已標(biāo)記探針進(jìn)行雜交的過程。濾膜雜交的基本過程 1. 核酸探針的制備和標(biāo)記；2. 核酸片段的凝膠電泳分離；3. 將凝膠中的核酸片段通過印跡（blot）轉(zhuǎn)移到某種固相支持物上；4. 用標(biāo)記的探針與被固定的靶核酸序列雜交；5. 洗膜（除去未雜交的游離探針等）；6. 檢測帶標(biāo)記的雜交分子（放射自顯影或酶聯(lián)反應(yīng)）。常見的幾種濾膜雜交1. Southern印跡：指將經(jīng)過電泳分離的DNA片斷轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物的過程。根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。Southern印跡雜交主要用于基因組結(jié)構(gòu)分析、基因組DNA的定性和定量分析以及利用限制性片段長度多態(tài)性進(jìn)行基因突變分析等。：是指RNA經(jīng)變性凝膠電泳后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物上，以便用雜交反應(yīng)檢測特定的mRNA分子的含量與大小。基本過程包括：RNA的提取、RNA變性電泳、RNA轉(zhuǎn)移和固定、雜交、檢測。 除RNA的提取和變性膠電泳與DNA不同外，其余基本與Southern印跡 同，關(guān)鍵是減少實(shí)驗(yàn)中的RNA酶污染。Northern blotting（諾賽恩RNA印跡技術(shù)）是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。3 蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Western blotting）：又稱為immunoblotting，指將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)的技術(shù)?；蛱结?probe)：就是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異核苷酸序列，它可以包括整個(gè)基因，也可以僅僅是基因的一部分，可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA探針的種類：基因組探針(genomic probe)；cDNA探針(cDNA probe)；寡核苷酸探針(人工合成的)。探針的標(biāo)記：放射性同位素：如32P；非同位素：如生物素、地高辛。理想標(biāo)記物特點(diǎn)，一種理想的標(biāo)記物，應(yīng)具備以下特性：①高度靈敏性；②標(biāo)記物與核酸探分子的結(jié)合，應(yīng)絕對(duì)不能影響其堿基配對(duì)特異性；③應(yīng)不影響探針分子的主要理化特性、雜交特異性和雜交穩(wěn)定性，雜交體的Tm應(yīng)無較大的改變；④檢測方法具有高度特異性。：靈敏度和特異性高、應(yīng)用廣泛；易造成放射性污染、半衰期短。如32P、3H和35S。:無放射性污染，穩(wěn)定性好；靈敏度和特異性不太高。半抗原、配體結(jié)合生物素、地高辛和熒光素。Probe synthesis：Nick Translation切口平移法、Random Priming隨機(jī)引物合成法、End labeling末端標(biāo)記法。 細(xì)菌轉(zhuǎn)化細(xì)菌轉(zhuǎn)化:是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株