單克隆抗體ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-05-06 13:10本頁(yè)面
【正文】 可得澄清的腹水。 ? ：用微孔濾膜過(guò)濾腹水，以除去較大的凝塊及脂肪滴；用 10000g 15分鐘高速離心（ 4℃ ）除去細(xì)胞殘?jiān)靶☆w粒物質(zhì)。 ? ：即上述兩法的組合，先將腹水高速離心，取上清液再用二氧化硅吸附處理。 （ 2） 單抗的粗提 ? A、 硫酸銨沉淀法 ? a. 飽和硫酸銨溶液的配制 ? b. 鹽析： ? c. 脫鹽： ? 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定： ? 分裝凍存?zhèn)溆谩? ? B、 辛酸 硫酸銨沉淀法 該法簡(jiǎn)單易行，適合于提純 IgG1和 IgG2b，但對(duì) IgG3和 IgA的回收率及純化效果差。 ? C、 優(yōu)球蛋白沉淀法 該法適用于 IgG3和 IgM型單抗的提取，所獲制品的抗體活性幾乎保持不變，對(duì) IgG3單抗的回收率高于 90%，對(duì) IgM單抗的回收率為 4090%不等。 （ 3）單抗的純化 ? 單抗純化的方法有很多種，應(yīng)根據(jù)具體單抗的特性和實(shí)驗(yàn)條件選擇適宜的方法，常用的技術(shù)有 DEAE離子交換層析柱、凝膠過(guò)濾法和親和層析法三種。 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)藥物存在問(wèn)題與發(fā)展方向 ? （ 1）細(xì)胞密度低，產(chǎn)物濃度低。 ? （ 2）大規(guī)模、長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中分泌產(chǎn)物能力易丟失，或產(chǎn)物活性易降低活性易降低。 ? （ 3） 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體很昂貴。因此大多僅能在小規(guī)模范圍內(nèi)研究，難以轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。 ? （ 4） 目前對(duì)細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的研究比較欠缺。 ? （ 5）在線監(jiān)測(cè)水平技術(shù)不完善，限制了優(yōu)良培養(yǎng)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)。 ? 今后應(yīng)重點(diǎn)開(kāi)展的工作 ? （ 1） 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程代謝和產(chǎn)物形成機(jī)制等方面的理論研究。 ? （ 2） 開(kāi)發(fā)能高密度生長(zhǎng)、大量分泌目標(biāo)產(chǎn)品的細(xì)胞系。 ? （ 3） 開(kāi)發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)性能優(yōu)良、細(xì)胞解解離容容易，并能重復(fù)使用的新型廉價(jià)的微載體。 ? （ 4） 研制高效的培養(yǎng)模式與系統(tǒng)，包括新型的無(wú)菌包括新型的無(wú)菌生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)與工藝、先進(jìn)的在線檢測(cè)、分析與自動(dòng)控制技術(shù)等。 ? （ 5）基因工程與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合的技術(shù)研究。 人源化單克隆抗體 ? 鼠源性單抗的局限： ? 不能激活補(bǔ)體及 Fc受體； ? 易被人體識(shí)別排斥； ? 易清除。 ? 人源化單抗的制備思路： ? 人鼠雜交瘤：人脾細(xì)胞 +鼠骨髓瘤 ? 人人雜交瘤：人脾細(xì)胞 +人骨髓瘤 ? 免疫缺陷小鼠： T、 B細(xì)胞均缺乏，易植入人免疫干細(xì)胞 ? 基因工程單抗 基因工程單抗 ? 單鏈抗體 ? 用一編碼親水易折疊多肽的人工合成寡核苷酸，將重鏈 V區(qū)（ 3ˊ ）與輕鏈 V區(qū)（ 5ˊ ）端連接在一起（ VHlinkerVL）即成單鏈抗體基因，將此基因克隆入原核或真核表達(dá)載體中，在原核或真核系統(tǒng)中表達(dá)出的蛋白質(zhì)即為單鏈抗體（ single chain antibodies）。 它能自發(fā)折疊成天然構(gòu)象，與抗原的結(jié)合力維持與原來(lái)完整抗體一樣。 基因工程單抗 ? 人 鼠嵌合抗體： 其原理是取某一 Mab基因的 V區(qū)，與人Ig基因的 C區(qū)連接，然后插入到表達(dá)質(zhì)粒中，傳染骨髓瘤細(xì)胞即產(chǎn)生出鼠 人嵌合抗體。 由于 Ig的 C區(qū)是人源的，這種抗體對(duì)人的免疫性就大為降低，采用不同亞類(lèi)的人 C區(qū)基因，便可改變抗體的效應(yīng)功能，以獲抗腫瘤的最佳效果。 鼠 人嵌合抗體并不能徹底清除鼠源免疫原性，于是進(jìn)一步提出重構(gòu)抗體的設(shè)想。 即：人化抗體 組合抗體庫(kù)技術(shù) ? 1985年 Smith將一基因片段克隆到載體噬菌體 fdtet的基因 Ⅲ （ g3）上，發(fā)現(xiàn)該基因所表達(dá)的蛋白與噬菌體基因 Ⅲ 表達(dá)的蛋白結(jié)合在一起呈現(xiàn)到噬菌體表面。這種表達(dá)的融合蛋白仍保留抗原特異性和生物活性，可通過(guò)相應(yīng)抗原進(jìn)行檢測(cè)。 ? 目的基因表達(dá)的蛋白如若想在噬菌體表面呈現(xiàn)，就必須插在這 5種外殼的其中一處。實(shí)驗(yàn)表明，在gp gp gp9中插入外源蛋白，都會(huì)影響其構(gòu)成外殼蛋白的功能，而在 gp8和 gp3的 N端插入外源蛋白后，形成的融合蛋白既可在噬菌體表面呈現(xiàn)，也不影響噬菌體的完整性和穩(wěn)定性。 ? 利用這一系統(tǒng)可以構(gòu)建表達(dá)性基因文庫(kù)，稱(chēng)為噬菌體呈現(xiàn)文庫(kù)。它最先被用于抗體基因文庫(kù)的構(gòu)建和篩選。 ? 雖然利用動(dòng)物的免疫可以獲得循環(huán)多克隆抗體，用細(xì)胞融合方法可以獲得單克隆抗體，但利用基因工程的技術(shù)構(gòu)建抗體基因庫(kù)，再篩選所需的特異性抗體，不僅擺脫了繁重的工作量，也可獲得大量的、穩(wěn)定的抗體。而且隨著研究的不斷深入和發(fā)展，抗體的多樣性，親和力也大有提高。
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1