親和色譜ppt課件-資料下載頁
2025-05-05 22:19本頁面
【正文】 附飽和。 ? 平衡緩沖溶液洗去未螯合的金屬離子 ? 加入適宜濃度的 NaCl和選擇合適 pH值有利于減少非特異性吸附。 解吸 吸附蛋白質(zhì)解吸的方法： ? 改變 pH值 ? 競爭性洗脫 ? 采用 50100mmol/L的 EDTA洗脫，可將蛋白質(zhì)和金屬離子解吸，洗滌，重新上柱平衡，固定所需的金屬離子。 pH與氯化銨濃度的影響 固定化親和離子色譜的應用 ? 基因修飾蛋白質(zhì)的純化 ? 遺傳修飾 → 具親和尾蛋白 → 色譜分離 → 親和尾切除 → 色譜分離 酶切位點 親和尾大小 54 染料親和色譜 ? 有機染料具有類似于 NAD+的結(jié)構(gòu) 。 ? 需核苷酸類物質(zhì)為輔酶的酶 ， 對染料具有一定親和力 。 ? 染料共價偶聯(lián)到瓊脂糖載體上 ， 能制得親和層析柱 。 ? 染料親和層析已成功的分離純化了多種酶 。 染料親和色譜介質(zhì)的制備 ? 配基性質(zhì)、染料結(jié)構(gòu)和染料取代度是制備過程中需要考慮的主要因素。 以下途徑可以實現(xiàn)制備： ? 采用瓊脂糖凝膠，染料連接在 OH上，該過程可在一定條件下直接完成。 ? 染料也可通過活性基團和基質(zhì)偶聯(lián)，該方法可引入高密度的染料。 吸附蛋白質(zhì)量增多 選擇親和作用力較小的染料有利于解吸 吸附與解吸 ? 采用磷酸鹽緩沖液，在 常用解吸方法： ? 增加鹽濃度 ? 改變 pH值 ? 采用水溶性高聚物 ? 親和洗脫 ? 最后對雜蛋白進行變性處理，洗滌、緩沖液平衡再生介質(zhì)。 免疫親和色譜 ? 抗原和抗體的作用具有高度的專一性 , 并且它們的結(jié)合親和力極強。因此用適當?shù)姆椒▽⒖乖蚩贵w結(jié)合到吸附劑上 , 便可有效地分離和純化免疫物質(zhì)。 ? 特點：分離效率高，成本高，而且蛋白質(zhì)親和配基不穩(wěn)定，容易降解。 免疫親和色譜過程 目標蛋白質(zhì) 抗體制備 上樣與洗脫 介質(zhì)制備 ? 單抗制備復雜，成本高，但也具有很多優(yōu)點。 色譜介質(zhì)制備： ? 將抗體通過化學方法結(jié)合在色譜介質(zhì)上 ? 抗體之間交聯(lián)形成不溶性衍生物 ? 單抗問世后 , 不少生物技術(shù)公司在研制適宜于培養(yǎng)雜交瘤細胞的生物反應器及其培養(yǎng)基。這些大規(guī)模生產(chǎn)單抗技術(shù)的建立和不斷完善 , 將降低免疫親和色譜吸附劑的價格。 ? 隨著新的合成基質(zhì)和偶聯(lián)化合物的出現(xiàn)以及對免疫親和色譜研究的深入 , 必將使免疫親和色譜在工業(yè)性生產(chǎn)純化蛋白質(zhì)的應用上逐漸得到發(fā)展。 解吸 ? 特異性解吸 —— 半抗原置換 ? 非特異性解吸 —— 調(diào)節(jié) pH值、加入試劑破壞氫鍵、引入離子對、加入表面活性劑、冷蒸餾水洗滌。 應用 ? 根據(jù)研究報道 , 用單克隆抗體親和色譜從人血小板破碎液中純化 血小板第 4 因子 (PF4)。將單克隆抗體 Sz 95 LgG 與溴化氰活化的 Spharose 4B 凝膠連接成親和色譜柱 , 人血小板破碎液經(jīng)此親和色譜柱上樣后 , 經(jīng)洗脫獲得 PF4。結(jié)果表明 , Sz95 Sepharose 4B 親和色譜柱的偶聯(lián)率為 72%, 每1mL血小板破碎液中可以純化到 PF4 18 μg。 基團專一性大分子親和色譜 ? 指用對某一類結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì)有親和性的大分子作為親和配基偶聯(lián)在色譜介質(zhì)上進行的色譜技術(shù)。 ? 蛋白 A親和色譜 ? 伴刀豆球蛋白 A親和色譜 ? 肝素親和色譜 1）分離純化大分子物質(zhì) 如：純化糖蛋白用凝集素（能可逆性地結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)）， LectinSepharose 4B 2) 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能： 分離有生物活性與失去生物活性的蛋白質(zhì)。 親和色譜的應用 樣品 tPA的純化 — 酶的抑制劑為親和配基 干擾素的純化 — 免疫親和色譜 脫氫酶的純化 — 色素親和色譜 淀粉酶抑制劑的純化 — 固定化金屬離子親和色譜 基因重組融合蛋白的純化
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