核酸的制備與提取ppt課件-資料下載頁
2025-05-05 00:31本頁面
【正文】 決定 40% 遺傳因素為主 外因?yàn)橹? 血友病 高血壓 腫瘤 一型糖尿病 外傷 所有疾病的發(fā)生都與基因密切相關(guān) 葉綠體中含有環(huán)狀DNA 細(xì)菌等原核生物 質(zhì)粒 染色體 線粒體中含有環(huán)狀 DNA Bas eSu g arA cid核 苷 酸 的基本 構(gòu)造 Monophosphate Diphosphate Triphosphate Adenine Guanine Thymine Cytosine Uracil Nucleoside (Adenosine) Nucleotide (Adenosine monophosphate, AMP) Purine Pyrimidine 核 苷 核 苷 酸 磷 酸 五 環(huán) 糖 Ribose, Deoxyribose 堿基 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 高速搗碎法：將組織加鹽水 (約 1／ 3～ 1／ 2)裝入搗碎機(jī)桶內(nèi)。用 10 000 r／min間斷離心，每次 30～ 60 s，防止離心時(shí)間過長(zhǎng)產(chǎn)生的熱破壞抗原活性。 高速組織搗碎機(jī) 高速搗碎法 玻璃勻漿器 研磨法用玻璃勻漿器。主要經(jīng)過旋轉(zhuǎn)、擠壓等方式將組織粉碎。用此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)高，對(duì)大分子的破壞也少。該法可用于粉碎少量軟嫩材料（腦、胰、肝等）時(shí)常用的方法。 玻璃勻漿器 ? 常用酶類： 溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等 ? 方法： 在一定的條件下，能消化細(xì)菌和 組織細(xì)胞。 ? 特點(diǎn)： ①此法適用多種微生物； ②具有作用條件溫和； ③內(nèi)含物成分不易受到破壞； ④細(xì)胞壁損壞的程度可以控制。 ? 原理： 在適當(dāng)?shù)臏囟取?pH及低離子強(qiáng)度的條 件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡， 使膜的滲透性改變或使之溶解。 ? 常用的有： 十二烷基硫酸鈉 (SDS,陰離子型 )、二乙胺十六烷基溴（陽離子型）、聚山梨酯（非離子型）、新潔爾滅等。 ? 應(yīng)用： ①破碎細(xì)菌，且作用比較溫和； ②提取基因組或質(zhì)粒 DNA的常用破碎方法。 各種堿基的紫外吸收光譜 EB與 DNA的結(jié)合 核酸的理化性質(zhì) ? 在細(xì)胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復(fù)合物形式存在 ? 微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機(jī)溶劑 ? 在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。 ? DNA溶液粘度很大， RNA的粘度較小 ? 在強(qiáng)大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來 DNA樣品準(zhǔn)備 ? 常見的標(biāo)本：血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等； ? 需要對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理； ? 生物組織：最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存－ 70℃ 或液氮。 ? EDTA的作用： ? 二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶； ? 降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。 ? SDS的作用： ? 溶解膜蛋白和脂肪，從而是細(xì)胞膜破裂； ? 溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來； ? 對(duì) RNA、 DNA酶有抑制作用； ? 與蛋白質(zhì)形成 ROSO3 ….R 蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性。 細(xì)胞的裂解 ? 蛋白酶 K：水解蛋白質(zhì)的作用，消化 DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。 ? 蛋白酶 K與其他蛋白酶相比，它具有更強(qiáng)的水解能力，而且在 SDS、 EDTA存在時(shí)仍保持較高活性，可同時(shí)使用。 蛋白質(zhì)變性 DNA的抽提 ? 酚可以使蛋白質(zhì)變性沉淀、抑制 DNA酶活性。 ? Tris溶液可以似的抽提出的 DNA進(jìn)入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。 ? 在酚或酚 氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實(shí)驗(yàn)中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。 DNA的沉淀 1. 無水乙醇沉淀 沉淀前往往加入 NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負(fù)電荷，有助于分子之間的聚集。 無水乙醇可以吸收分子之間的水，使 DNA沉淀析出，無水乙醇使用前冰凍，可以減少 DNA沉淀析出過程釋放熱量對(duì) DNA的損傷。 2. 異丙醇沉淀 除了使 DNA沉淀外，還可以溶解少量的小的 RNA分子。 ? 應(yīng)用溴化乙錠一氯化銫密度梯度平衡超離心，很容易將不同構(gòu)象的 DNA, RNA及蛋白質(zhì)分開。這個(gè)方法是目前實(shí)驗(yàn)室中純化質(zhì)粒 DNA時(shí)最常用的方法。如果應(yīng)用垂直轉(zhuǎn)頭，每分鐘65000轉(zhuǎn)（ Beckman L一 70超離心機(jī)），只要6h可以完成分離工作。但是如果采用角轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)速為每分鐘 45 000轉(zhuǎn)時(shí)，則需 16h。離心完畢后，離心管中各種成分的分布可以在紫外光照射下顯示得一清二楚（圖 15一 2),蛋白質(zhì)漂浮在最上面， RNA沉淀在底部，超螺旋 DNA沉降較快，開環(huán)及線型 DNA沉降較慢。 經(jīng)染料 氯化銫密度梯度超離心后，質(zhì)粒 DNA及各種雜質(zhì)的分布 超螺旋DNA 閉環(huán)質(zhì)粒DNA 開環(huán)質(zhì)及線型 DNA 蛋白質(zhì) 石蠟油 5．質(zhì)粒 DNA的純化
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