【正文】 N H2NHNNHNN HANNHN H2ONHNHN HOC二、核酸是兩性化合物 （一）堿基可發(fā)生互變異構(gòu) 酮式 烯醇式 氨式 亞氨式 目 錄 （二）堿基在體液環(huán)境中以堿性解離為主 （三）核酸分子是酸性化合物 核酸為多元酸，具有較強的酸性 。 可與金屬離子成鹽，不溶于乙醇或異丙醇 目 錄 三、核酸溶液有高分子性質(zhì) 粘度 ： DNA RNA、 dsDNA ssDNA 粘度大，易斷裂。 沉降系數(shù) ： 不同空間結(jié)構(gòu)，沉降速率不同； 線性 環(huán)狀 超螺旋的 DNA； 超速離心分離。 目 錄 四、核酸有紫外線吸收的特性 核酸的紫外吸收： OD260 單核苷酸 ssDNA（或 RNA） dsDNA 目 錄 堿基的紫外吸收光譜 目 錄 1. DNA或 RNA的定量 OD260= 50μg/ml雙鏈 DNA 40μg/ml單鏈 DNA（或 RNA） 20μg/ml寡核苷酸 2. 判斷核酸樣品的純度 DNA純品 : OD260/OD280 = RNA純品 : OD260/OD280 = OD260的應(yīng)用 目 錄 五、核酸具有 變性、復(fù)性和雜交行為 定義 ： 在理化因素作用下， DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。 本質(zhì)： 破壞氫鍵，改變空間結(jié)構(gòu)。 方法： 強酸、堿，加熱，變性試劑（尿素、酰胺）、有機溶劑（乙醇、丙酮）等。 理化性質(zhì)變化 ： OD260增高 . （一）核酸變性時空間構(gòu)象破壞 目 錄 DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂 目 錄 變性引起紫外吸收值的改變 DNA的紫外吸收光譜 ?增色效應(yīng)： DNA變性時其溶液 OD260增高的現(xiàn)象 。 目 錄 DNA的解 鏈 曲線 連續(xù)加熱 DNA的過程中以溫度相對于 A260值作圖 ， 所得的曲線稱為 解鏈曲線 。 解鏈過程中 ， 紫外吸光度的變化達到最大變化值的一半時所對應(yīng)的溫度 。 解鏈溫度 (melting temperature， Tm) 熱變性 目 錄 解鏈溫度 (melting temperature, Tm) ： 變性是在一個相當窄的溫度范圍內(nèi)完成 。 （二） Tm值是 DNA變性的重要參數(shù) 在變性溫度范圍內(nèi)，紫外吸收值達到最大值的 50%時的溫度稱為 DNA的解鏈溫度 ，又稱融解溫度。 目 錄 Tm值的影響因素： 1． DNA均一性決定熔解溫度范圍大小： 均質(zhì) DNA Tm范圍小、異質(zhì) DNA Tm范圍大。 2． GC堿基對含量決定熔解溫度高： GC與 Tm值呈正比 3．介質(zhì)中的離子強度影響變性： 離子強度低、易變性， Tm低； 高鹽保存。 目 錄 （三）變性的核酸可以復(fù)性與分子雜交 DNA復(fù)性 (renaturation)： 在適當條件下，變性 DNA的兩條互補鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為 復(fù)性 。 退火 (annealing)： 熱變性的 DNA經(jīng)緩慢冷卻后復(fù)性，這一過程稱為 退火 。 1．變性的核酸可復(fù)性 目 錄 減色效應(yīng)： DNA復(fù)性時，其溶液 OD260降低 。 DNA復(fù)性影響因素 ： 分子量大、濃度小、重復(fù)序列多，復(fù)性快 目 錄 2. 具有同源序列的核酸分子可相互雜交 核酸分子雜交 （ hybridyzation） ： 不同來源 ， 但具互補序列的核酸 ， 按堿基配對原則形成 雜化雙鏈 的過程 。 雜化雙鏈： DNA與 DNA分子， DNA與 RNA分子， RNA與 RNA分子間形成。 目 錄 DNADNA 雜交雙鏈分子 變性 復(fù)性 不同來源的DNA分子 目 錄 目 錄 目 錄 核酸分子雜交的應(yīng)用 （ 1） Southern印跡 可檢測 DNA （ 2） Northern印跡 用于檢測 RNA Western印跡 用于檢測蛋白質(zhì) （ 3）斑點印跡雜交 (Dot blot) （ 4） DNA芯片 (DNA microarray)技術(shù)也是 利用核酸雜交原理設(shè)計的。 目 錄 第 五 節(jié) 核 酸 酶 Nucleases 目 錄 核酸酶 是指所有可以水解核酸的酶 一、核酸酶的分類有多種方法 （一）按底物專一性分類 DNA酶 (deoxyribonuclease, DNase)： 專一降解 DNA。 RNA酶 (ribonuclease, RNase)： 專一降解 RNA。 目 錄 （二）按對底物作用方式不同分類 核酸內(nèi)切酶： 限制性核酸內(nèi)切酶 非特異性限制性核酸內(nèi)切酶。 核酸外切酶： 5?→3 ?或 3?→5 ?核酸外切酶。 （三）按對底物二級結(jié)構(gòu)的專一性分類 雙鏈酶： 作用于雙鏈核酸 單鏈酶： 作用于單鏈核酸 目 錄 二、核糖核酸酶是一類 RNA內(nèi)切酶 （一）胰核糖核酸酶 (RNase1): 嘧啶核苷酸 （二） RNaseT1: 鳥嘌呤核苷酸 （三） RNaseT2: 腺嘌呤核苷酸 目 錄 3種核酸酶作用位點 Py: 嘧啶 核苷酸 。 Pu: 嘌呤 核苷酸 目 錄 三、脫氧核糖核酸酶是一類 DNA消化酶 （一）胰 DNaseⅠ ： 切割單鏈 /雙鏈，產(chǎn)物 DNA是 5?磷酸末端的寡聚核苷酸 （二）脾 DNase Ⅱ ： 產(chǎn)物是 3?磷酸末端的寡聚核苷酸 （三） BAL 31 核酸酶： DNA外切酶活性為主。 （四）限制性內(nèi)切核酸酶： 具有位點特異性。 目 錄 四、 N糖苷酶可移去堿基 N糖苷酶 （ glycosidase） ： 水解核苷酸的 N糖苷鍵 ， 切除核苷酸的堿基 。 有堿基特異性或非特異性的糖苷酶 。 目 錄 第六節(jié) 重要的核酸分離、分析技術(shù) Techniques for Isolation and Identification of Nuclear Acids 目 錄 一 、分離核酸有多種方法 （一）酚抽提法是分離核酸的基本方法 1．酚抽提法可抽提 DNA 2．酚抽提法也可提取 RNA （二）超速離心可分離核酸 （三）凝膠電泳法分離核酸很常用 （四）層析法分離核酸與分離蛋白質(zhì)原理基本相同 1．親和層析法分離特異核酸 2．凝膠過濾層析又稱分子篩過濾 目 錄 （一） Sanger法又稱雙脫氧終止法 （二） Maxam和 Gilbert法是化學裂解測序 （三） tRNA序列分析比 DNA測序更復(fù)雜 二、兩種方法常用于核苷酸序列測定 目 錄 +d dA T PG AT T CG dd AG dd AG AT T CG AG CT G dd AG AT T CG AG Cdd TG AT dd TG Ad dT+d dT T PG AT T CG AG dd CG AT T dd C+d dCT POH539。CT A A G CT CG A CT339。d CT P d G T P d A T P d T T P+G AT T CG AG CT dd GG AT T CG Ad dGG AT T Cdd GddG+d dG T P A C G TAGTCGAGCTTAG339。123456789101112 Sanger雙脫氧法 DNA測序 返回 目 錄 雙脫氧三磷酸核苷酸 N N N N 9 N H 2 O H H H H H C H 2 H 1 39。2 39。 O P O O O P O O O P O H O O ddATP 目 錄 目的和要求 掌握： 核酸的組成與一級結(jié)構(gòu)； DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型特點； mRNA和 tRNA結(jié)構(gòu)與功能； 核酸理化性質(zhì)及其應(yīng)用。 熟悉： DNA超螺旋結(jié)構(gòu)與 DNA的功能； rRNA的結(jié)構(gòu)與功能； 核酸酶與核酶。