研究生細胞凋亡ppt課件-資料下載頁
2025-05-04 07:51本頁面
【正文】 結(jié)構(gòu)； Ⅱ a期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚 、邊緣化； Ⅱ b期細胞凋亡的晚期 ， 細胞核裂解為碎塊 ， 產(chǎn)生凋亡小體 。 二 、 磷脂酰絲氨酸外翻分析 （ Annexin V法 ） 磷脂酰絲氨酸 （ Phosphatidylserine, PS） 正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè) ， 但在細胞凋亡的早期 ， PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面 ， 暴露在細胞外環(huán)境中 。 AnnexinV是一種分子量為 35~36KD的 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白 ， 能與 PS高親和力特異性結(jié)合 。將 AnnexinV進行熒光素 （ FITC、 PE） 或 biotin標(biāo)記 ，以標(biāo)記了的 AnnexinV作為 熒光探針 ， 利用 流式細胞儀或熒光顯微鏡 可檢測細胞凋亡的發(fā)生 。 碘化丙啶 (propidine iodide, PI)是一種 核酸染料 ， 它不能透過完整的細胞膜 ， 但在凋亡中晚期的細胞和死細胞 ， PI能夠透過細胞膜而使 細胞核紅染 。 因此將 AnnexinV與 PI匹配使用 ， 就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來 。 三 、 線粒體膜勢能的檢測 線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用 ， 多種細胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細胞發(fā)生凋亡 ， 而 線粒體跨膜電位 DYmt的下降 ， 被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件 ， 它發(fā)生在細胞核凋亡特征 （ 染色質(zhì)濃縮 、 DNA斷裂 ） 出現(xiàn)之前 ， 一旦線粒體 DYmt崩潰 ， 則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn) 。 線粒體跨膜電位的存在 ， 使一些 親脂性陽離子熒光染料 可結(jié)合到線粒體基質(zhì) ， 其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低 。 四 、 DNA片斷化檢測 細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮 , 染色質(zhì) DNA 在核小體 單位之間 的連接處 斷裂 , 形成50~300kbp長的 DNA大片段 , 或 180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段 。 大分子染色體 DNA片段的測定 細胞凋亡的早期 ,染色體斷裂成為 50~300kbp長的DNA大片段 。 其 不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離 。通常采用 脈沖電泳技術(shù) 。 180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜 (DNA ladder)。 細胞經(jīng)處理后 ， 采用常規(guī)方法分離提純 DNA， 進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色 ， 在凋亡細胞群中可觀察到典型的 DNA ladder。 如果細胞量很少 ， 還可在分離提純 DNA后 ， 用 32PATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶 使 DNA標(biāo)記 ，然后進行電泳和放射自顯影 ， 觀察凋亡細胞中 DNA ladder的形成 。 五 、 末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù) TUNEL法 細胞凋亡中 , 染色體 DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂 而產(chǎn)生大量的 339。OH末端 ， 可在 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶 的作用下 ， 將 脫氧核糖核苷酸 和熒光素 、 過氧化物酶 、 堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物 標(biāo)記 到 DNA的 339。末端 ， 從而可進行凋亡細胞的檢測 ， 這類方法稱為 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（ terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL） 。 由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有 DNA的斷裂 ， 因而沒有 339。OH形成 ， 很少能夠被染色 。 凋亡癌細胞胞核見紫藍色陽性顆粒 TUNEL法 TUNEL技術(shù)檢測 BAK基因過表達后癌細胞凋亡 六 、 Caspase3活性的檢測 Caspase家族在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用 ， 其中 caspase3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子 ， 它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能 。 Caspase3正常以 酶原 （ 32KD） 的形式存在于胞漿中 ， 在 凋亡的早期 階段 ， 它被激活 ， 活化的 Caspase3由兩個 大亞基 （ 17KD）和兩個 小亞基 （ 12KD） 組成 ， 裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物 ， 最終導(dǎo)致細胞凋亡 。 但在 細胞凋亡的晚期和死亡細胞 ， caspase3的活性明顯下降 。 Western blot 分析 分析 Procaspase3， 活化的 Caspase3及其對底物多聚 （ ADP 核糖 ） 聚 合 酶 [poly （ ADPribose ）polymerase， PARP]等的裂解 。 熒光分光光度計分析 原理：活化的 Caspase3 能夠特異切割D1E2V3D4X底物 ， 水解 D4X肽鍵 。 根據(jù)這一特點 ， 設(shè)計出 熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽 AcDEVDAMC。 在 共價偶聯(lián)時 ， AMC不能被激發(fā)熒光 ，短肽被水解后釋放出 AMC， 自由的 AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光 。 根據(jù)釋放的 AMC熒光強度的大小 ， 可以測定 caspase3 的活性 ， 從而反映Caspase3被活化的程度 。 流式細胞術(shù)分析 流式細胞計分析 caspase3陽性細胞數(shù)和平均熒光強度 。 七 、 酶聯(lián)免疫吸附法 （ ELISA)核小體測定 凋亡細胞的 DNA斷裂使 細胞質(zhì)內(nèi) 出現(xiàn)核小體 。 核小體由組蛋白及其伴隨的 DNA片斷組成 ， 可由 ELISA法檢測 。 將凋亡細胞裂解后高速離心 ， 其上清液中含有核小體 在微定量板上吸附組蛋白抗體 加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合 加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗 DNA抗體使之與核小體上的 DNA結(jié)合 加酶的底物 ， 測光吸收 。 該法敏感性高 ， 但是不能精確測定凋亡細胞發(fā)生的絕多對量 。
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