【正文】 亞硝基胍誘變 HdMHr581（ Hase+2MHr） HdTr14 HdTr51 （ TRAr+Haser） P20轉(zhuǎn)導(dǎo) HT2892 （ Hase+2MHr+TRAr） ?利用轉(zhuǎn)導(dǎo)法選育精氨酸產(chǎn)生菌 ?選育關(guān)鍵：精氨酸合成系統(tǒng)酶不受阻遏、初始酶的反饋抑制脫敏、精氨酸分解能力喪失。 RA4240 PA3179（ Lys） ArgA+LysA共轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo)子（ Lys+） AT404 ?利用轉(zhuǎn)導(dǎo)法選育蘇氨酸產(chǎn)生菌 ?選育關(guān)鍵：生物合成限速酶 AK和 DH、與蘇氨酸分解相關(guān)的蘇氨酸脫氫酶和蘇氨酸脫氨酶。 ?產(chǎn)生菌具備： （ 1）蘇氨酸脫氫酶和蘇氨酸脫氨酶缺陷 （ 2）解除 AK和 DH的反饋調(diào)節(jié) 8000（野生菌） Mu910（ TDH） D60（ TDH+TD） HNr31 HNr59（ 解除反饋?zhàn)瓒簦? HNr21（ 解除反饋抑制） AECr174 N11 E60 T570 T693 轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo) 蘇氨酸轉(zhuǎn)導(dǎo)育種 三、利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法選育氨基酸生產(chǎn)菌 ?轉(zhuǎn)化：相當(dāng)大的游離的供體細(xì)胞 DNA片段被直接吸收到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的基因組中，從而使受體細(xì)胞獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。 ?供體 DNA制備 ?受體細(xì)胞對(duì) DNA吸收 ?轉(zhuǎn)化子的選擇 供體菌 制備 DNA片段 受體菌 制備原生質(zhì)體 PEG轉(zhuǎn)化 選擇培養(yǎng) 轉(zhuǎn)化子 性能鑒定 第三節(jié) 用重組 DNA技術(shù)構(gòu)建氨基酸工程菌 重組 DNA技術(shù)亦稱基因工程 定向育種的重要技術(shù) ?工具酶 ?限制性內(nèi)切酶 ?DNA連接酶 ?寄主 載體系統(tǒng) 質(zhì)粒是重要的載體。 ?載體的要求 1）較小的分子質(zhì)量 2）選擇性標(biāo)記 3）高表達(dá)的啟動(dòng)子 4）數(shù)種限制內(nèi)切酶的單位切點(diǎn) 5）能在寄主細(xì)胞中多拷貝復(fù)制 供體菌 DNA片段 質(zhì)粒 重組質(zhì)粒 受體菌 選擇培養(yǎng)基 轉(zhuǎn)化子 重 組 DNA 技 術(shù) 第四節(jié) 氨基酸產(chǎn)生菌的穩(wěn)定化 ?防止回復(fù)突變的產(chǎn)生與增殖 ?定向選育增加遺傳標(biāo)記的產(chǎn)生菌株 通過增加遺傳標(biāo)記的方法，提高菌株抗回復(fù)突變的能力。 ?選育遺傳性狀穩(wěn)定的菌株 1）反復(fù)傳代培養(yǎng) 2）紫外線照射 ?改良培養(yǎng)基組成 例如：添加結(jié)構(gòu)類似物。 ?添加藥物，抑制回復(fù)突變的產(chǎn)生 利用某些抗生素，對(duì)菌株的抑制濃度不同 ?生產(chǎn)管理 定期純化、減少種子級(jí)數(shù)。 ?使用改善了世代時(shí)間的菌株 縮短世代時(shí)間。 ?防止噬菌體污染 以預(yù)防為主的綜合環(huán)境治理。 第六節(jié) 氨基酸的提取與精制 發(fā)酵液 ↓ 預(yù)處理（加熱、調(diào)整 pH、絮凝） ↓ 菌體分離（離心、過濾、膜分離） ↓ 提?。ǔ恋?、吸附、離子交換、萃取、電滲析） ↓ 高度純化（超濾、吸附、結(jié)晶、重結(jié)晶） ↓ 成品加工（干燥、分裝） 第十一章 天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵 ?主要包括： ?天冬氨酸 ?賴氨酸 ?高絲氨酸 ?蘇氨酸 ?蛋氨酸 ?異亮氨酸。 第一節(jié) 天冬氨酸族氨基酸生物合成途徑 葡萄糖 丙酮酸 四碳二羧酸 天冬氨酸 天冬氨酸半醛 二氫吡啶 2， 6二羧酸 賴氨酸 高絲氨酸 Ο琥珀酰 高絲氨酸 蘇氨酸 異亮氨酸 蛋氨酸 第二節(jié) 菌種選育策略（略） 第三節(jié) 影響天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵因素 ?發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的添加 丙酮酸 草酰乙酸 丙酮酸 天冬氨酸酸 檸檬酸酸 谷氨酸 生物素過量！ ?發(fā)酵培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)缺陷型營(yíng)養(yǎng)物的添加 ?典型的代謝控制發(fā)酵，菌株帶有多重遺傳標(biāo)記，營(yíng)養(yǎng)缺陷型營(yíng)養(yǎng)物添加濃度直接影響發(fā)酵產(chǎn)酸。 ?要求： 1）種子培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富。 2）發(fā)酵培養(yǎng)基保持亞適量。 ?溶解氧控制 ?要求： 菌體呼吸充足，產(chǎn)酸較高。 ?發(fā)酵中的回復(fù)突變 參看菌種遺傳穩(wěn)定性部分。 第四節(jié) 賴氨酸發(fā)酵 ?生產(chǎn)菌選育的思路 ?切斷或減弱之路代謝 選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型或滲漏菌株可達(dá)到賴氨酸積累的目的。 葡萄糖 丙酮酸 四碳二羧酸 天冬氨酸 天冬氨酸半醛 二氫吡啶 2， 6二羧酸 賴氨酸 高絲氨酸 Ο琥珀酰 高絲氨酸 蘇氨酸 異亮氨酸 蛋氨酸 切斷支路 強(qiáng)化代謝 ?解除反饋調(diào)節(jié) ?限速酶 1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ PC） 受到天冬氨酸的反饋抑制，可通過篩選結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株，丙氨酸缺陷型等方法解除。 2）天冬氨酸激酶 受到蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同反饋抑制，可通過選育結(jié)構(gòu)類似物的抗性突變株解除反饋抑制。 3）二氫二吡啶二羧酸合成酶（ PS） 受到亮氨酸的代謝互鎖。 ?解除代謝互鎖 賴氨酸生物合成與亮氨酸存在代謝互鎖。 ?解除代謝互鎖的方法： 1）選育亮氨酸缺陷型 2）選育抗結(jié)構(gòu)類似物菌株 3）溫度敏感型 4）選育滲漏性菌株（抗苯醌、喹啉衍生物） ?改善膜的通透性 ?增加前體物質(zhì)的合成 切斷支路，增加前體物質(zhì)。 1）選育丙氨酸缺陷型 2）選育抗天冬氨酸結(jié)構(gòu)類似物 3）選育合適的 co2固定和 TCA循環(huán)比 ?選育溫度敏感型突變株 ?選育脲酶回復(fù)突變株 ?利用基因工程技術(shù)構(gòu)建工程菌。 第五節(jié) 蘇氨酸發(fā)酵 ?蘇氨酸高產(chǎn)菌具備的生化特征 1）二氧化碳固定反應(yīng)強(qiáng) 2）天冬氨酸合成能力強(qiáng) 3）天冬氨酸激酶活性強(qiáng) 4）高絲氨酸脫氫酶活力強(qiáng) 5）二氫二吡啶二羧酸合成酶活力弱或喪失 6）琥珀酰高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶活力弱或喪失 7）谷氨酸脫氫酶活力弱 8）蘇氨酸脫氨酶活力弱或喪失 天冬氨酸 天冬氨酸半醛 二氫吡啶 2， 6二羧酸 賴氨酸 高絲氨酸 Ο琥珀酰 高絲氨酸 蘇氨酸 異亮氨酸 蛋氨酸 切斷支路 強(qiáng)化代謝 ?選育蘇氨酸生產(chǎn)菌的方法 ?切斷支路 選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型是有效的方法。 ?解除反饋調(diào)節(jié) 選育抗結(jié)構(gòu)類似物菌株是有效的方法。解除關(guān)鍵酶天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶的反饋抑制。 ?增加前提物質(zhì)天冬氨酸的合成 1）選育抗天冬氨酸結(jié)構(gòu)類似物菌株 2）選育丙酮酸缺陷型 3）強(qiáng)化從丙酮酸到蘇氨酸代謝流 ?選育 FPs突變株 ?以琥珀酸為唯一碳源生長(zhǎng)良好的菌株 ?減弱或消除丙酮酸激酶和檸檬酸合成酶 ?生物素過量 ?切斷蘇氨酸進(jìn)一步代謝途徑 ?選育異亮氨酸缺陷型或滲漏型菌株 ?利用生物技術(shù)選育高產(chǎn)菌株 1）利用轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化方法 2）利用原生質(zhì)體融合方法 3）基因工程技術(shù)構(gòu)建工程菌 第六節(jié) 蛋氨酸發(fā)酵 ?蛋氨酸高產(chǎn)菌株的生化特征 1）二氧化碳固定反應(yīng)強(qiáng) 2）天冬氨酸合成能力強(qiáng) 3）天冬氨酸激酶活性強(qiáng) 4）高絲氨酸脫氫酶活力強(qiáng) 5）二氫二吡啶二羧酸合成酶活力弱或喪失 6）琥珀酰高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶活力強(qiáng) 7） s腺苷蛋氨酸合成酶喪失 ?蛋氨酸高產(chǎn)菌株育種思路 ?解除反饋調(diào)節(jié) 1）解除自身的反饋調(diào)節(jié)，篩選抗蛋氨酸結(jié)構(gòu)類似物菌株。 2）選育抗 SAM結(jié)構(gòu)類似物菌株 3）解除蘇氨酸和賴氨酸對(duì)天冬氨酸激酶的協(xié)同反饋抑制 ?切斷支路代謝 選育缺陷型 ?切斷蛋氨酸向下反應(yīng)的通路 選育抗性菌株。 天冬氨酸半醛 二氫吡啶 2， 6二羧酸 賴氨酸 高絲氨酸 Ο琥珀酰 高絲氨酸 蘇氨酸 異亮氨酸 蛋氨酸 S腺苷蛋氨酸 第十二章 鳥氨酸、瓜氨酸、精氨酸發(fā)酵 ?三種氨基酸之間相互轉(zhuǎn)化 → → 鳥氨酸 瓜氨酸 精氨酸 谷氨酸 N乙酰谷氨酸 N乙酰谷氨酸磷酸 鳥氨酸 瓜氨酸 精氨酸琥珀酸 精氨酸 N乙酰鳥氨酸半醛 N乙酰鳥氨酸 N乙酰谷氨酸合成酶 N乙酰鳥氨酸酶 N乙酰谷氨酸和 N乙酰 鳥氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶 共軛反應(yīng)催化 ?精氨酸發(fā)酵 不能采用阻斷代謝流、選育缺陷型的方法來選育生產(chǎn)菌。 精氨酸是該代謝途徑的最終產(chǎn)物，且合成途徑?jīng)]有分支代謝。 一、精氨酸發(fā)酵代謝控制育種策略 采用抗反饋調(diào)節(jié)突變株，以解除精氨酸自身的反饋調(diào)節(jié)，使精氨酸得以積累。 谷氨酸為精氨酸生物合成的前體物質(zhì)，選育抗性菌株、敏感型菌株強(qiáng)化谷氨酸生物合成，有利于精氨酸的產(chǎn)量提高。 切斷精氨酸進(jìn)一步向下代謝的途徑，如：選育喪失精氨酸分解能力的菌株 采用基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)精氨酸生產(chǎn)菌。 二、由突變菌株發(fā)酵生產(chǎn)精氨酸 物理、化學(xué)誘變的方法選育帶有多重遺傳標(biāo)記，解除反饋調(diào)節(jié)的菌株。 三、由轉(zhuǎn)導(dǎo)子發(fā)酵生產(chǎn)精氨酸 利用轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，選育高產(chǎn)菌株。 四、工程菌的構(gòu)建 克隆與精氨酸合成相關(guān)基因，制備重組質(zhì)粒，導(dǎo)入宿主，構(gòu)建工程菌。 第十三章 異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸發(fā)酵 ?由于都具有甲基側(cè)鏈，也被稱為分支鏈氨基酸。 亮氨酸 異亮氨酸 纈氨酸 丙酮酸 α乙酰乳酸 αβ二羥基異戊酸 α酮基異戊酸 L纈氨酸 乙酰 CoA α異丙基蘋果酸 α酮基異己酸 L亮氨酸 支鏈氨基酸生物合成途徑 ?纈氨酸發(fā)酵 一、 L纈氨酸的生產(chǎn)方法 ?動(dòng)物血粉、蠶蛹及毛發(fā)水解液中，利用離子交換法提取 L纈氨酸。 ?特點(diǎn)： 1）操作簡(jiǎn)單、周期短、提取率高。 2）成本高 ?化學(xué)合成法制備 DL纈氨酸，經(jīng)外消旋體拆開（如用酰基 DL氨基酸酶水解）。 ?特點(diǎn)： 1）成本高 2）反應(yīng)復(fù)雜、步驟多、副產(chǎn)物多。 ?發(fā)酵法 ?特點(diǎn)： 原料成本低、反應(yīng)條件溫和及容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn) ?添加前體物質(zhì)發(fā)酵法（微生物轉(zhuǎn)化法） ?直接發(fā)酵法 二、 L纈氨酸生產(chǎn)菌的育種策略 丙酮酸 α乙酰乳酸 αβ二羥基異戊酸 α酮基異戊酸 L纈氨酸 乙酰 CoA α異丙基蘋果酸 α酮基異己酸 L亮氨酸 ?合成中第一限速酶受 L纈氨酸的反饋抑制，另外合成酶系受三個(gè)末端產(chǎn)物的多價(jià)阻遏。 ?通過選育抗結(jié)構(gòu)類似物菌株，提高 L纈氨酸的產(chǎn)量。 ?通過選育以琥珀酸為唯一碳源生長(zhǎng)慢 ?丙氨酸缺陷型 喪失纈氨酸分解能力喪失菌株 第十四章 色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸 ?三種氨基酸的分子中都含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，稱芳香族氨基酸。 ?三種氨基酸直鏈部分都是丙氨酸 ?色氨酸：吲哚基 磷酸烯醇式丙酮酸 赤蘚糖 4磷酸 3脫氧 α阿拉伯庚酮糖酸 分支酸 莽草酸 預(yù)苯酸 對(duì)羥苯丙酮酸 苯丙酮酸 L酪氨酸 L苯丙氨酸 鄰氨基苯甲酸 L色氨酸 ?色氨酸發(fā)酵 一、 L色氨酸的生產(chǎn)方法 ?利用微生物中 L色氨酸合成酶系的催化功能生產(chǎn)色氨酸 吲哚 +DL絲氨酸 L色氨酸 +水 色氨酸合成酶、絲氨酸消旋酶 IMH L色氨酸 +氨 +水 三種水解酶 吲哚 +L絲氨酸 L色氨酸 +水 色氨酸合成酶、絲氨酸消旋酶 吲哚 +丙酮酸 +氨 L色氨酸 +水 色氨酸酶 二、 L色氨酸育種策略