【正文】 稀釋法 4）好氧、厭氧生物氧化方法均適用 5）選擇經(jīng)濟(jì)有效的方法 第十章 氨基酸生產(chǎn)菌的選育與發(fā)酵技術(shù) 第一節(jié) 氨基酸生產(chǎn)菌的選育與定向育種思路 ?選育抗代謝調(diào)節(jié)突變株 選育結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株 1）優(yōu)點(diǎn) ?獲得氨基酸生產(chǎn)菌的有效方法 ?生產(chǎn)穩(wěn)定 ?方法簡便 ?易于保存，不易回復(fù)突變 2）結(jié)構(gòu)類似物作用機(jī)理 ?與變構(gòu)酶的變構(gòu)部位結(jié)合 ?阻遏酶的合成 ?抑制氨酰基 tRNA合成酶活性 ?抑制對應(yīng)氨基酸向細(xì)胞內(nèi)攝取 3）增強(qiáng)結(jié)構(gòu)類似物抑制生長的方法 ?改變碳源或氮源 ?添加抑制劑 ?選擇缺陷菌株 ?添加合成酶的抑制劑 ?增大結(jié)構(gòu)類似物的細(xì)胞膜透性 ?優(yōu)先合成轉(zhuǎn)換 ?增加前體物質(zhì)的積累 ?除去終產(chǎn)物 ?選育條件突變菌株 ?選育不生成副產(chǎn)物菌株 ?選育代謝拮抗物質(zhì)菌株 第二節(jié) 用細(xì)胞內(nèi)基因重組手段選育氨基酸生產(chǎn)菌 ?細(xì)胞內(nèi)基因重組是自然界普遍存在的現(xiàn)象，稱為雜交育種。 ?原因 1）濃縮結(jié)晶溫度高 2）貯晶槽濃度偏高、母液滯留結(jié)晶表面 3）干燥溫度高、結(jié)晶表面失水松花 4）篩選震動(dòng)篩頻率過高，磨損晶體表面 ?解決措施 1）控制溫度，防止失去結(jié)晶水。 ? 飽和溶液 ：當(dāng)溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下的飽和溶解度時(shí)，該溶液稱為飽和溶液； ? 過飽和溶液 ：溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度時(shí)，該溶液稱之為過飽和溶液； – 溶質(zhì)只有在過飽和溶液中才能析出 ； 結(jié)晶的步驟 ?過飽和溶液的形成 ?晶核的形成 ?晶體生長 ?工藝流程 濃縮 ↓ 起晶 ↓ 整晶 ↓ 育晶 ↓ 養(yǎng)晶 ?結(jié)晶的過程通常包括晶核的形成和晶體的長大兩個(gè)階段。 ?噬菌體檢查方法 ?雙層平板法 ?劃線法 ?液體培養(yǎng)法 出現(xiàn)“二高三低”現(xiàn)象 ?發(fā)酵液 OD值不上升或者回降 ?產(chǎn)酸低 ?發(fā)酵溫度低 ? pH升高，可到 ?殘?zhí)歉? （ 1）噬菌體污染的防止措施 以環(huán)境凈化為中心的綜合治理 ?定期檢查噬菌體 ?嚴(yán)禁活菌體排放 ?殺滅環(huán)境中的噬菌體 ?殺滅壓縮空氣中的噬菌體 ?嚴(yán)格無菌操作 ?避免噬菌體侵入設(shè)備 （ 2）污染噬菌體后的挽救措施 ?并罐法 （噬菌體不能侵染產(chǎn)酸期細(xì)胞） ?菌種輪換 （不交叉感染） ?放罐重消法 （高溫滅菌） ?低溫滅菌法 （ 1）染菌原因分析 ?從染菌時(shí)間分析 ?早期：培養(yǎng)基滅菌不徹底 ?中后期：設(shè)備滲漏、空氣系統(tǒng) ?從染菌類型分析 ?芽孢桿菌：滅菌不徹底 ?球菌、酵母等：設(shè)備滲漏 ?從染菌幅度分析 ?個(gè)別罐：參照上面 ?大面積罐：空氣系統(tǒng)、種子 （ 2）預(yù)防措施 ?空氣凈化 ?培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌 ?設(shè)備安裝 ?接種操作 （ 3）補(bǔ)救措施 ?補(bǔ)加種子 ?補(bǔ)加糖 ?直接放罐 第六章 谷氨酸的提取 第一節(jié) 概 述 ?將谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵液中積累的 L谷氨酸提取出來 ,再進(jìn)一步中和、除鐵、脫色、加工精制成谷氨酸單鈉鹽叫提煉。 ?供氧對谷氨酸發(fā)酵的影響 葡萄糖氧化的需氧量： 徹底氧化 1： 6 合成代謝產(chǎn)物： 1： 必須連續(xù)向發(fā)酵液通入氧。 我國主要使用：玉米、大米、淀粉、糖蜜。 ?種子罐的滅菌 ?空消 4060min ?實(shí)消 118℃ 5min ?培養(yǎng)條件 接種量： ~％ 培養(yǎng)溫度： 32~34℃ 培養(yǎng)時(shí)間： 7~8h ?通風(fēng)量： 通風(fēng)比：單位體積發(fā)酵液單位時(shí)間通過的空氣量 (v/) 50L種子罐 1:、攪拌轉(zhuǎn)速 340r／ min； 250L種子罐 1:、攪拌轉(zhuǎn)速 300r／ min 500L種子罐 1:、攪拌轉(zhuǎn)速 230r／ min ?二級種子的質(zhì)量要求 種齡： 7~8h pH： OD值凈增 無菌檢查 () 噬菌體檢查 () ? 影響種子質(zhì)量的主要因素 ? 培養(yǎng)基 氮源豐富、生物素充足、碳源較少。 第五節(jié) 應(yīng)用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 ?應(yīng)用原生質(zhì)體融合新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 ?應(yīng)用轉(zhuǎn)化法選育谷氨酸生產(chǎn)菌 ?應(yīng)用轉(zhuǎn)導(dǎo)法選育谷氨酸生產(chǎn)菌 ?應(yīng)用重組 DNA技術(shù)構(gòu)建谷氨酸工程菌 ?應(yīng)用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸 第六節(jié) 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 ?菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 斜面菌種 → 一級種子培養(yǎng) → 二級種子培養(yǎng) →發(fā)酵罐 （ 1） 斜面菌種的培養(yǎng) 葡萄糖 %，蛋白陳 %，牛肉膏 %，氯化鈉 %，瓊脂 ~%，pH ~（傳代和保藏斜面不加葡萄糖）。 （ 2）感染噬菌體后的形態(tài) ?前期感染 細(xì)胞明顯減少，形態(tài)不規(guī)則，發(fā)圓、發(fā)胖，缺乏八字排列，有明顯細(xì)胞碎片，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)拉絲、拉網(wǎng)。 ?控制關(guān)鍵：添加時(shí)間與用量 3）油酸缺陷型 作用機(jī)制：阻斷油酸合成。 %100)( ??? ）糖液相對密度（）干物質(zhì)濃度（ 還原糖濃度 dDE ? ? ?糖液中葡萄糖含量占干物質(zhì)的百分率。 糖化酶的用量： 100120 u/干淀粉。 。 ?采用篩選法分離。 ?味精廠的主要生產(chǎn)車間 ?糖化車間 ?發(fā)酵車間 ?提取車間 ?精制車間 第一章 淀粉水解糖的制備 第一節(jié) 淀粉的組成及其特性 一、淀粉的性狀及組成 ?性狀 白色無定形結(jié)晶粉末。 緒論 ?采用誘變、細(xì)胞工程、基因工程的手段選育出從遺傳角度解除了反饋調(diào)節(jié)和遺傳性穩(wěn)定的更理想菌種 ,提高產(chǎn)酸 。 緒論 第三節(jié) 氨基酸的應(yīng)用 ?醫(yī)藥 ① Glu治療肝昏迷。 緒論 緒論 ?截至 2022年 ,全球飼料中蘇氨酸的需求量每年約為 11萬 t,中國的需求量約為 2萬 t。 1908年從海帶中提取了 Glu，并制取了味之素。 氨基酸工藝學(xué) 生命科學(xué)系 課程內(nèi)容 ?緒論 ?谷氨酸發(fā)酵 ?其他氨基酸發(fā)酵 參考書 ?氨基酸工藝學(xué) 陳寧 中國輕工業(yè)出版社 ?氨基酸發(fā)酵工藝學(xué) 張克旭 中國輕工業(yè)出版社 ?味精工業(yè)手冊（第二版） 于信令 中國輕工業(yè)出版社 學(xué)習(xí)目的 ?以探討氨基酸發(fā)酵工廠的生產(chǎn)技術(shù)為主要目的。 1910年日本人開始利用小麥面筋工業(yè)化制取味精。目前 ,在蘇氨酸領(lǐng)域研究開發(fā)處于世界領(lǐng)先水平的是日本味之素公司 ,它是全球最大的蘇氨酸生產(chǎn)公司 ,總產(chǎn)能每年達(dá)到 t,大約占全球市場份額 60%。 ② 氨基酸大輸液。 ?采用過程控制 ,進(jìn)行最優(yōu)化控制 ,連續(xù)化、自動(dòng)化 ,穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn) 。 形狀為：圓形、橢圓形、多角形。 ?原理：利用相對密度不同。 MPa。 第一章 淀粉水解糖的制備 ?α淀粉酶 （ 1）生產(chǎn)菌 枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、米曲霉、黑曲霉、擬內(nèi)孢霉等等。 %100)( ??? ）糖液相對密度（）干物質(zhì)濃度（ 葡萄糖濃度 dDE ? ??糖化工藝條件 pH:177。 4）甘油缺陷型 ?作用機(jī)制：喪失了 α 磷酸甘油脫氫酶 5）溫度敏感型 添加青霉素的強(qiáng)制發(fā)酵工藝。 ?中后期感染 形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊，有毛刺，有細(xì)胞碎片。 典型的分批發(fā)酵工藝流程圖 菌種提純瓊脂斜面接種搖瓶蒸汽鍋爐空氣壓縮機(jī)種子培養(yǎng)種子罐無菌空氣空氣過濾器通氣生物反應(yīng)主要發(fā)酵罐pH 調(diào)節(jié)液蒸汽滅菌連消裝置培養(yǎng)基配料罐培養(yǎng)基原料培養(yǎng)基配料去菌體分離及后處理檢測控制成品 （ 2）一級種子培養(yǎng) 葡萄糖 %，尿素 %，硫酸鎂 %，磷酸氫二鉀 %，玉米漿 ~%(按質(zhì)增減 )， 。 ? 溫度 避免溫度過高和波動(dòng)較大 ? pH 0時(shí)不宜過高，培養(yǎng)結(jié)束不易過低 ? 溶解氧 溶氧水平不易過高。 ?氮源 ： 100（ 1530） 無機(jī)氮源 : (1)尿素 (2) 液氨 (3)氨水 有機(jī)氮源 : 主要是蛋白質(zhì)、胨、氨基酸等。 菌體生長期：滿足菌體合成的需要，過低，副產(chǎn)物增加，影響菌體收率。 ?分為：提取和精制 ?在提取車間和精制車間完成。首先在溶液中產(chǎn)生細(xì)小的晶核 ,隨后以這些晶核為中心 ,繼續(xù)在晶核表面吸附周圍溶質(zhì)分子 ,使晶粒不斷長大。 2）控制濃度，母液應(yīng)分離干凈 3）控制好干燥溫度和時(shí)間 4）調(diào)整好震動(dòng)頻率，縮短物料停留時(shí)間 ?現(xiàn)象：味精發(fā)黃、紅、灰等顏色 ?原因 1）味精發(fā)黃 ? 色素混入 ? 母液分離不凈 ? 干燥溫度過高、時(shí)間長 ? 色素洗脫帶入味精 3）味精發(fā)紅 ? 除鐵不凈 ? 接觸鐵器 ? 樹脂、碳柱再生不徹底 4）味精發(fā)灰、發(fā)青 ? 活性炭粉末混入 ? 硫化鈉過量 4）味精久放變黃 ? 亞鐵離子氧化 ? 谷氨酸殘?zhí)呛扛?，結(jié)晶體發(fā)黃，吸潮后更黃。 ?原生質(zhì)體融合 ?轉(zhuǎn)導(dǎo) ?轉(zhuǎn)化 ?原生質(zhì)轉(zhuǎn)化 一、利用原生質(zhì)融合技術(shù)選育氨基酸生產(chǎn)菌 ?原生質(zhì)融合 將遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞融合稱為一個(gè)新細(xì)胞的技術(shù)。 ?三個(gè)必需組成 ?供體菌 ?受體菌 ?轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 供體菌 擴(kuò)大培養(yǎng) 加入噬菌體 繼續(xù)培養(yǎng) 氯仿殺菌 離心 上清液 DNase處理 微孔膜過濾 裂解液 受體菌 擴(kuò)大培養(yǎng) 混合 離心 受體菌體 選擇培養(yǎng)基 轉(zhuǎn)導(dǎo)子 性能鑒定 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 育 種 操 作 ?利用轉(zhuǎn)導(dǎo)法選育組氨酸產(chǎn)生菌 ?選育的關(guān)鍵：解除組氨酸生物合成過程的反饋抑制與阻遏；同時(shí)，組氨酸酶缺陷。 ?使用改善了世代時(shí)間的菌株 縮短世代時(shí)間。 第四節(jié) 賴氨酸發(fā)酵 ?生產(chǎn)菌選育的思路 ?切斷或減弱之路代謝 選育營養(yǎng)缺陷型或滲漏菌株可達(dá)到賴氨酸積累的目的。 ?解除反饋調(diào)節(jié) 選育抗結(jié)構(gòu)類似物菌株是有效的方法。 切斷精氨酸進(jìn)一步向下代謝的途徑，如：選育喪失精氨酸分解能力的菌株 采用基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)精氨酸生產(chǎn)菌。 ?特點(diǎn)： 1）成本高 2）反應(yīng)復(fù)雜、步驟多、副產(chǎn)物多。 ?通過選育抗結(jié)構(gòu)類似物菌株，提高 L纈氨酸的產(chǎn)量。 三、由轉(zhuǎn)導(dǎo)子發(fā)酵生產(chǎn)精氨酸 利用轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，選育高產(chǎn)菌株。 ?增加前提物質(zhì)天冬氨酸的合成 1）選育抗天冬氨酸結(jié)構(gòu)類似物菌株 2）選育丙酮酸缺陷型 3）強(qiáng)化從丙酮酸到蘇氨酸代謝流 ?選育 FPs突變株 ?以琥珀酸為唯一碳源生長良好的菌株 ?減弱或消除丙酮酸激酶和檸檬酸合成酶 ?生物素過量 ?切斷蘇氨酸進(jìn)一步代謝途徑 ?選育異亮氨酸缺陷型或滲漏型菌株 ?利用生物技術(shù)選育高產(chǎn)菌株 1）利用轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化方法 2）利用原生質(zhì)體融合方法 3