核酸分離檢測ppt課件-資料下載頁
2025-05-02 18:41本頁面
【正文】 結果 取材 新鮮組織 、 細胞；盡快冷凍或固定 雜交前所有用具 RNase free 固定 ? 目的：保持細胞形態(tài)結構 ， 最大限度地保存細胞內 RNA水平；使探針易于進入細胞或組織 。 ? 最常用多聚甲醛 （ 4%） 固定組織 ， 因其不會與蛋白質產生廣泛的交叉連接 ， 不會影響探針穿透入細胞或組織 。 ? 醋酸 、 酒精的混合液和 Bouin′s固定劑 包埋、切片 ? 石蠟切片：固定組織用 PBS沖洗后 ， 經梯度酒精脫水 、 二甲苯透明和浸蠟包埋切片 。 ? 冰凍切片：組織固定后 ， 30%蔗糖處理過夜 ， OCT包埋 、 切片 ， 80 ℃ 保存?zhèn)溆?。 OCToptimum cutting temperature pound ?聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物 ?在冰凍切片時支撐組織，以增加組織的連續(xù)性，減少皺折及碎裂。 ?漂片時可溶于水，不增加背景染色。 全自動脫水機（ Tissue Prosessing） 石蠟組織包埋機（ Embedding） 包埋用具 包埋后的組織蠟塊 石蠟切片機（ Microtome） 展片機 冰凍切片機 （ Cyrostat） 探針的制備 ?特異性 cDNA探針： 制備困難 ?cRNA探針： 以 cDNA為模板，體外轉錄獲得，單鏈探針， cRNA－ RNA雜交體穩(wěn)定； RNase敏感 ?人工合成寡核苷酸探針 ： DNA合成儀合成，不需要純化，組織穿透性極好；長短控制，過長 ——錯配，過短 —— 特異性差 ?探針長度：＜ 500堿基 探針標記方法 ?末端標記法： 將標記物導入線型 RNA的 5’端或 3’端，適用于合成寡核苷酸探針的標記，一般攜帶的標記分子較少。 ?體外轉錄法： 模板 —— 線性化質粒 DNA/PCR產物（含 T T3或 SP6啟動子）， RNA聚合酶， NTP（一種標記帶標記）所有的 RNA就被標記。 末端標記法 堿性磷酸酶 T4多聚核苷酸激酶 ? T4 多核苷酸激酶是一種磷酸化酶，可將 ATP 的 g磷酸基轉移至 DNA 或 RNA 的 539。 末端。 體外轉錄基因克隆載體 體外轉錄標記 標記物 ?同位素 ?非同位素標記技術有生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶和熒光素 —— 直接標記、間接標記 地高辛標記技術 ? Digoxigenin （ DIG），源于從洋地黃類植物中提取的類固醇。洋地黃花和葉片為 Digoxigenin在自然界中的唯一來源，抗 DIG的抗體不會與其他的生物物質結合，高特異性。 ? 靈敏度高。 DIG檢測靈敏度接近同位素而無放射性危險、相比熒光則不需要特殊檢測設備，相比生物素則沒有樣本內源干擾之苦。 地高辛的結構 Structure of Alkaliliable Digoxigenin(DIG)dUTP AP（堿性磷酸酶）標記抗 DIG抗體檢測 堿性磷酸酶顯色試劑 ? BCIP/NBT ? BCIP (5Bromo4chloro3indolyl phosphate) 5溴 4氯 3吲哚基 磷酸鹽＋ NBT (四唑硝基藍 ) 是堿性磷酸酶最佳的底物組合之一。 ? 在堿性磷酸酶的催化下， BCIP會被水解而產生強反應性的產物，該產物與 NBT發(fā)生反應，形成不溶性的深藍色至藍紫色化合物。 相關設備 雜交爐 雜交 ?脫蠟 ：二甲苯脫蠟 ，逐級梯度酒精 (100%、 95%、90%、 80%、 70%)清洗，蒸餾水洗。 ?固定 ?通透 ：蛋白酶（蛋白酶 K/proteinase K，鏈霉蛋白酶 /pronase和胃蛋白酶 /pepsin)消化包圍靶 RNA的蛋白質，促進探針滲透，提高雜交信號。過度消化引起細胞形態(tài)結構的破壞、靶核酸的減少、導致標本從載玻片上的脫落。 ?再固定 ?酸酐處理：防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結合，以降低背景 ?脫水 ?預雜交 ：阻斷玻片和標本與探針的非特異性結合減低背景 ?雜交：探針變性，過夜，溫度、濕度 ?洗滌： SSC緩沖液洗除未雜交探針 ?顯色：抗體（ antidigap—— 堿性磷酸酶）孵育，底物顯色；復燃（蘇木精、快綠） ?脫水、封片
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