【正文】 等濃度洗脫條件的設(shè)計(jì)是相似的 . 一旦流動相的組成固定 , 由其決定的k’值也就固定了，那么就可以對梯度洗脫或等濃度洗脫的保留力進(jìn)行預(yù)測 . ? 因而 , 分離度可以由下式來描述 . Rs = (1/4)[(a1)/a][K/(K+1)] 梯度曲線 保留時間 溶質(zhì)在柱中的位置 在梯度洗脫中，對于在柱中移動的溶質(zhì)分子， k’ 的平均值 (K) 指其瞬時的 k’值 . 瞬時 k’ 值 平均 k’值 (K) K= tG F / Vm DF S tG : 梯度時間 F : 流速 Vm : 柱的死體積 DF : 梯度變化率 S : Isocratic parameter Vm = toF S=100a [(log(k’) = a(B%) + b] 20 80 0 30 (min) (%) tG = 30 DF = ?80 ?20? /100 = 梯度曲線 等濃度 梯度 梯度洗脫中每個峰都有相似的半峰寬 . 這一點(diǎn)和等濃度 洗脫是完全不同的。雖然 對分離度來說 Rs 是非常重要的參數(shù)， 在梯度洗脫中，平均 k’ (K) 實(shí)際上是更有意義的。 梯度分離的改善 為了改善分離 , 根據(jù)下式， a, N 和 K 應(yīng)該被提高 Rs = (1/4)[(a1)/a][K/(K+1)] 實(shí)際上由于 K是最主要的影響因子 , K 值應(yīng)該被增加 (1) 梯度時間 (2) 流速 (3) 梯度改變率 以上因素的改變基于下面的最優(yōu)化方程 K= tG F / Vm DF S K的初始值 ? 增加流速會使 K值變得更大 .然而，由于流速增加會引起高壓，所以其增加是有限度的 . ? 開始時，固定流速可能會更好 . ? 梯度時間和 梯度改變率 需要優(yōu)化 . ? 最初 : K=5 因?yàn)? k’應(yīng)該在 1 至 20 ， 210更好 , k’平均值 (K)開始應(yīng)該固定在 5 開始梯度比 (DF) 和其他參數(shù) ? 由于開始 B的濃度梯度范圍應(yīng)該是從 0%到 100% c. 因此，開始的 梯度改變率 (DF) 應(yīng)該是 1. DF = [(最后 %B)(開始 l %B)]/100 = ?100%?0%?/100 = 1 ? 柱死體積 (Vm) mmID x 15cmL : mL mmID x 25cmL : mL mmID x 15cmL : mL ? 流速 (F) : 2 mL/min ? 等度參數(shù) (S) 分子量 S 100 4 1,000 10 10,000 30 100,000 100 開始梯度洗脫時間 (tG) ?如果 梯度范圍 0% 100% : DF = 1 柱尺寸 x 15cmL : Vm = 流速 : mL/min 樣品分子量小于 100 : S = 4 K 值 (開始時 ) : 5 ? 開始的梯度時間應(yīng)為 23 min. K= tG F / Vm DF S 5= tG x 1 / ( x x 1 x 4) tG= 5 x x 1 x 4 / 1 = 23 min 梯度洗脫時間的優(yōu)化 (tG) DF = (5% 95%) Vm = mL/min S = 4 K =5 tG = = 20(min) 0 10 20 (min) 95% 5% to 4 min 16 min 12 min 延遲時間 23% 77% 梯度洗脫濃度范圍和時間的優(yōu)化 (tG) 5% 95% (20min) 25% 77% (12min) 梯度洗脫方法的進(jìn)一步優(yōu)化 如果需要進(jìn)一步的優(yōu)化 , (1) 梯度時間更長 (tG) (2) 流速更快 (3) 使用更長或更好的柱子 (4) 改變有機(jī)溶劑 (甲醇 乙腈 THF) 梯度洗脫中的問題 1 ? 重復(fù)性差 ?柱子平衡時間不夠 ?通常，柱子再生的時間應(yīng)該大致等于梯度時間 tG. ?如果開始的流動相是水或緩沖液，平衡時間要更長 . 因此，在開始梯度洗脫時用 5％或者更高濃度的有機(jī)溶劑比較好 ?使用自動進(jìn)樣器縮小平衡時間的差異 ? 鬼峰 ?水的級別低 ?水中的一些不純物引起鬼峰 . ?使用了不純的水 . ?降低檢測波長可能會檢測不到不純物 . ?在開始梯度洗脫時用 5％或者更高濃度的有機(jī)溶劑比較好 梯度洗脫中的問題 2 方法認(rèn)證 準(zhǔn)確度 精確度 ?重復(fù)性 ?中間重復(fù)性 ?重現(xiàn)性 檢出限 檢測限 線性 回收率 范圍 穩(wěn)定性 判斷分析能力的典型參數(shù) 范圍 ? 定義 : 能夠給出適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確度，精確度和線性的被分析物的高低濃度之間的間隔 . 從 LOQ 到 線性水平之上 準(zhǔn)確度 ? 定義 : 試驗(yàn)值和實(shí)際值之間的差 [ 評價方法 ] 應(yīng)該在所有范圍內(nèi)評價準(zhǔn)確度 . 可以用回收率來進(jìn)行判定 . 要求有 3 個以上不同濃度的樣品 三次以上的進(jìn)樣 . 置信度 ? 置信度意味著我們能用信心指數(shù)來進(jìn)行判定 , 也就是置信度范圍包括真實(shí)值 (m)的可能性 ,.置信度范圍的大小 在很大程度上我們對真實(shí)值的確信程度，確信程度越高，置信度范圍越大 下面的方程給出了置信度為 95%, 99% 時的真實(shí)值 ( c )范圍 c (n)1/2 m c + (n)1/2 95% c (n)1/2 m c + (n)1/2 99% 乙酰水楊酸的準(zhǔn)確度測試 C o nc . 80% 90% 100% 110% 120%1 st r un 7 9 .2 9 0 .8 9 9 .3 1 0 9 .0 1 2 0 .92 nd r un 7 9 .7 9 0 .2 1 0 0 .8 1 0 9 .7 1 2 0 .13 r d r un 8 0 .6 8 9 .7 1 0 0 .4 1 1 0 .6 1 1 9 .44 t h r un 8 0 .0 8 9 .3 9 9 .1 1 1 0 .5 1 2 0 .75 t h r un 8 0 .4 9 0 .5 9 9 .9 1 0 9 .1 1 1 9 .2平均值 (每個級別 ) dj = S{(yji (100/xj)}/m 100 dj 平均值 (所有級別 ) d = SS{(yij (100/xj)}/mn 100 置信區(qū)間 [ d (mn)1/2 , d + (mn)1/2 ] 平均值 (d) : 置信區(qū)間 : [, ] m=level(5), n=repeat(5) 線性 ? 定義 : 所測樣品濃度以及準(zhǔn)確度測定的樣品濃度應(yīng)該在線性范圍內(nèi) . [ 評價方法 ] 應(yīng)該在所有范圍內(nèi)對線性進(jìn)行評價 . 可以用回歸系數(shù)來進(jìn)行判定 . 截距和斜率應(yīng)該被顯示 進(jìn)行線性確認(rèn)，應(yīng)該有 5個以上不同濃度的樣品被檢測 乙酰水楊酸的線性測試 C o nc . 80% 90% 100% 110% 120%1 st r un 7 9 .2 9 0 .8 9 9 .3 1 0 9 .0 1 2 0 .92 nd r un 7 9 .7 9 0 .2 1 0 0 .8 1 0 9 .7 1 2 0 .13 r d r un 8 0 .6 8 9 .7 1 0 0 .4 1 1 0 .6 1 1 9 .44 t h r un 8 0 .0 8 9 .3 9 9 .1 1 1 0 .5 1 2 0 .75 t h r un 8 0 .4 9 0 .5 9 9 .9 1 0 9 .1 1 1 9 .20% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 140%64202460 20 40 60 80 100 120 140乙酰水楊酸的線性評價 相關(guān)系數(shù) : r = S{(xi Sxi/n) (yi Syi/n)} {[S(xi Sxi/n)][S(yi Syi/n) 2]}1/2 斜率 : b = S{(xi Sxi/n) (yi Syi/n)} S(xi Sxi/n) 2 截距 : a = Syi/n bSxi/n r = , a = , b = 相關(guān)系數(shù)大于 精確度 ? 定義 : 相同分析條件下多次測量的數(shù)據(jù)之間的相近度 ? 三個組分 重復(fù)性 中間精密度 重現(xiàn)性 重復(fù)性 通過對相同樣品的多次進(jìn)樣來測量表達(dá) HPLC系統(tǒng)的性能 [ 評價方法 ] 用 RSD來表達(dá) , 由一種樣品在相同條件下多次測定組成 . 重復(fù)性應(yīng)該在所有范圍內(nèi)進(jìn)行評價 ? 最少進(jìn)樣 5次 乙酰水楊酸的重復(fù)性測試 C o nc . 80% 90% 100% 110% 120%1 st r un 7 9 .2 9 0 .8 9 9 .3 1 0 9 .0 1 2 0 .92 nd r un 7 9 .7 9 0 .2 1 0 0 .8 1 0 9 .7 1 2 0 .13 r d r un 8 0 .6 8 9 .7 1 0 0 .4 1 1 0 .6 1 1 9 .44 t h r un 8 0 .0 8 9 .3 9 9 .1 1 1 0 .5 1 2 0 .75 t h r un 8 0 .4 9 0 .5 9 9 .9 1 0 9 .1 1 1 9 .2標(biāo)準(zhǔn)偏差 (每個級別 ) sj = {S(yji S yji/m)2/(m1)}1/2 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (每個級別 ) RSDj = sj / (Syji/m) m=level(5) RSD(%) 中間精密度 ? 估算方法的可靠性不同于方法的開發(fā)。 在日間，不同的實(shí)驗(yàn)者之間，不同儀器間的測試等 ? 當(dāng)方法開發(fā)結(jié)束后，確認(rèn)對于相似的樣品方法能提供相同的結(jié)果 ? [ 評價方法 ] 用 RSD來表達(dá)， 最少兩個不同場合的數(shù)據(jù)來確認(rèn)方法的精密度 乙酰水楊酸的中間精密度測試 Test 1 Test 2 1st run % % 2nd run % % 3rd run % % 4th run % % 5th run % % SD RSD (%) (%) F(Ftest) = s12 / s22 = / = 自由度 = 4 (P=) 在 5％水平時這兩種測試方法的不同有重要的意義 重現(xiàn)性 ? 定義 : 重現(xiàn)性是指在合作研究的實(shí)驗(yàn)室之間的精密度 檢出限 定量范圍 檢出限 可以檢測出的最低濃度 , 不要求定量 . 檢測限 可以接受的精確度和準(zhǔn)確度時可以確定的最低檢測濃度 [ 評價方法 ] ? 信噪比法 ? 標(biāo)準(zhǔn)偏差和校準(zhǔn)曲線法 檢出限 : S/N= 2 (or 3) 定量限 : S/N=10 信噪比 信噪比 50ppm : S/N=200mm/1mm=200 ? ppm : S/N=2 (N = 1mm) (S = 200mm) 濃度 =50 ppm ? = 標(biāo)準(zhǔn)偏差和校準(zhǔn)曲線的斜率 檢出限 : s/S 定量限 : 10 s/S s : 響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差 S : 校準(zhǔn)曲