【正文】 梯度分離的改善 為了改善分離 , 根據(jù)下式， a, N 和 K 應(yīng)該被提高 Rs = (1/4)[(a1)/a][K/(K+1)] 實際上由于 K是最主要的影響因子 , K 值應(yīng)該被增加 (1) 梯度時間 (2) 流速 (3) 梯度改變率 以上因素的改變基于下面的最優(yōu)化方程 K= tG F / Vm DF S K的初始值 ? 增加流速會使 K值變得更大 .然而，由于流速增加會引起高壓，所以其增加是有限度的 . ? 開始時，固定流速可能會更好 . ? 梯度時間和 梯度改變率 需要優(yōu)化 . ? 最初 : K=5 因為 k’應(yīng)該在 1 至 20 ， 210更好 , k’平均值 (K)開始應(yīng)該固定在 5 開始梯度比 (DF) 和其他參數(shù) ? 由于開始 B的濃度梯度范圍應(yīng)該是從 0%到 100% c. 因此，開始的 梯度改變率 (DF) 應(yīng)該是 1. DF = [(最后 %B)(開始 l %B)]/100 = ?100%?0%?/100 = 1 ? 柱死體積 (Vm) mmID x 15cmL : mL mmID x 25cmL : mL mmID x 15cmL : mL ? 流速 (F) : 2 mL/min ? 等度參數(shù) (S) 分子量 S 100 4 1,000 10 10,000 30 100,000 100 開始梯度洗脫時間 (tG) ?如果 梯度范圍 0% 100% : DF = 1 柱尺寸 x 15cmL : Vm = 流速 : mL/min 樣品分子量小于 100 : S = 4 K 值 (開始時 ) : 5 ? 開始的梯度時間應(yīng)為 23 min. K= tG F / Vm DF S 5= tG x 1 / ( x x 1 x 4) tG= 5 x x 1 x 4 / 1 = 23 min 梯度洗脫時間的優(yōu)化 (tG) DF = (5% 95%) Vm = mL/min S = 4 K =5 tG = = 20(min) 0 10 20 (min) 95% 5% to 4 min 16 min 12 min 延遲時間 23% 77% 梯度洗脫濃度范圍和時間的優(yōu)化 (tG) 5% 95% (20min) 25% 77% (12min) 梯度洗脫方法的進(jìn)一步優(yōu)化 如果需要進(jìn)一步的優(yōu)化 , (1) 梯度時間更長 (tG) (2) 流速更快 (3) 使用更長或更好的柱子 (4) 改變有機(jī)溶劑 (甲醇 乙腈 THF) 梯度洗脫中的問題 1 ? 重復(fù)性差 ?柱子平衡時間不夠 ?通常，柱子再生的時間應(yīng)該大致等于梯度時間 tG. ?如果開始的流動相是水或緩沖液，平衡時間要更長 . 因此，在開始梯度洗脫時用 5％或者更高濃度的有機(jī)溶劑比較好 ?使用自動進(jìn)樣器縮小平衡時間的差異 ? 鬼峰 ?水的級別低 ?水中的一些不純物引起鬼峰 . ?使用了不純的水 . ?降低檢測波長可能會檢測不到不純物 . ?在開始梯度洗脫時用 5％或者更高濃度的有機(jī)溶劑比較好 梯度洗脫中的問題 2 方法認(rèn)證 準(zhǔn)確度 精確度 ?重復(fù)性 ?中間重復(fù)性 ?重現(xiàn)性 檢出限 檢測限 線性 回收率 范圍 穩(wěn)定性 判斷分析能力的典型參數(shù) 范圍 ? 定義 : 能夠給出適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確度，精確度和線性的被分析物的高低濃度之間的間隔 . 從 LOQ 到 線性水平之上 準(zhǔn)確度 ? 定義 : 試驗值和實際值之間的差 [ 評價方法 ] 應(yīng)該在所有范圍內(nèi)評價準(zhǔn)確度 . 可以用回收率來進(jìn)行判定 . 要求有 3 個以上不同濃度的樣品 三次以上的進(jìn)樣 . 置信度 ? 置信度意味著我們能用信心指數(shù)來進(jìn)行判定 , 也就是置信度范圍包括真實值 (m)的可能性 ,.置信度范圍的大小 在很大程度上我們對真實值的確信程度，確信程度越高，置信度范圍越大 下面的方程給出了置信度為 95%, 99% 時的真實值 ( c )范圍 c (n)1/2 m c + (n)1/2 95% c (n)1/2 m c + (n)1/2 99% 乙酰水楊酸的準(zhǔn)確度測試 C o nc . 80% 90% 100% 110% 120%1 st r un 7 9 .2 9 0 .8 9 9 .3 1 0 9 .0 1 2 0 .92 nd r un 7 9 .7 9 0 .2 1 0 0 .8 1 0 9 .7 1 2 0 .13 r d r un 8 0 .6 8 9 .7 1 0 0 .4 1 1 0 .6 1 1 9 .44 t h r un 8 0 .0 8 9 .3 9 9 .1 1 1 0 .5 1 2 0 .75 t h r un 8 0 .4 9 0 .5 9 9 .9 1 0 9 .1 1 1 9 .2平均值 (每個級別 ) dj = S{(yji (100/xj)}/m 100 dj 平均值 (所有級別 ) d = SS{(yij (100/xj)}/mn 100 置信區(qū)間 [ d (mn)1/2 , d + (mn)1/2 ] 平均值 (d) : 置信區(qū)間 : [, ] m=level(5), n=repeat(5) 線性 ? 定義 : 所測樣品濃度以及準(zhǔn)確度測定的樣品濃度應(yīng)該在線性范圍內(nèi) . [ 評價方法 ] 應(yīng)該在所有范圍內(nèi)對線性進(jìn)行評價 . 可以用回歸系數(shù)來進(jìn)行判定 . 截距和斜率應(yīng)該被顯示 進(jìn)行線性確認(rèn)，應(yīng)該有 5個以上不同濃度的樣品被檢測 乙酰水楊酸的線性測試 C o nc . 80% 90% 100% 110% 120%1 st r un 7 9 .2 9 0 .8 9 9 .3 1 0 9 .0 1 2 0 .92 nd r un 7 9 .7 9 0 .2 1 0 0 .8 1 0 9 .7 1 2 0 .13 r d r un 8 0 .6 8 9 .7 1 0 0 .4 1 1 0 .6 1 1 9 .44 t h r un 8 0 .0 8 9 .3 9 9 .1 1 1 0 .5 1 2 0 .75 t h r un 8 0 .4 9 0 .5 9 9 .9 1 0 9 .1 1 1 9 .20% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 140%64202460 20 40 60 80 100 120 140乙酰水楊酸的線性評價 相關(guān)系數(shù) : r = S{(xi Sxi/n) (yi Syi/n)} {[S(xi Sxi/n)][S(yi Syi/n) 2]}1/2 斜率 : b = S{(xi Sxi/n) (yi Syi/n)} S(xi Sxi/n) 2 截距 : a = Syi/n bSxi/n r = , a = , b = 相關(guān)系數(shù)大于 精確度 ? 定義 : 相同分析條件下多次測量的數(shù)據(jù)之間的相近度 ? 三個組分 重復(fù)性 中間精密度 重現(xiàn)性 重復(fù)性 通過對相同樣品的多次進(jìn)樣來測量表達(dá) HPLC系統(tǒng)的性能 [ 評價方法 ] 用 RSD來表達(dá) , 由一種樣品在相同條件下多次測定組成 . 重復(fù)性應(yīng)該在所有范圍內(nèi)進(jìn)行評價 ? 最少進(jìn)樣 5次 乙酰水楊酸的重復(fù)性測試 C o nc . 80% 90% 100% 110% 120%1 st r un 7 9 .2 9 0 .8 9 9 .3 1 0 9 .0 1 2 0 .92 nd r un 7 9 .7 9 0 .2 1 0 0 .8 1 0 9 .7 1 2 0 .13 r d r un 8 0 .6 8 9 .7 1 0 0 .4 1 1 0 .6 1 1 9 .44 t h r un 8 0 .0 8 9 .3 9 9 .1 1 1 0 .5 1 2 0 .75 t h r un 8 0 .4 9 0 .5 9 9 .9 1 0 9 .1 1 1 9 .2標(biāo)準(zhǔn)偏差 (每個級別 ) sj = {S(yji S yji/m)2/(m1)}1/2 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (每個級別 ) RSDj = sj / (Syji/m) m=level(5) RSD(%) 中間精密度 ? 估算方法的可靠性不同于方法的開發(fā)。 + 1) c on t r i b u t i on1 1/ 2 2 2/ 3 3 3/ 4 4 4/ 5 10 10/ 11 20 20/ 21 50 50/ 51 100 100/ 101 影響分離度的因素 怎樣提高 N 第一步 ? HETP = 柱長 / N 范 德米特方程 HETP 線速率 最佳流速 每個柱子都有最佳流速 HETP (或 N) 和 流速 ?要獲得好的柱效 , mmID mL/min mmID mL/min mmID mL/min 以上設(shè)置是最佳的 . 增加柱子數(shù)目 1 2 3 4 5 6 7 8 柱子數(shù)量 雖然增加柱子數(shù)量能提高 N, 但是分離度僅僅能增加 40％ . 同時柱壓會劇烈增加 . 增加柱子數(shù)量并不實用 mmID mL/min mmID mL/min mmID mL/min N Flow rate 3 mm 10 mm 5 mm 降低填料粒徑并且選擇每根柱子的最佳流速 . 如果改變了粒徑 , 必須使用相同的填充物 . 否則會改變選擇性 怎樣提高 N 第二步 降低有機(jī)溶劑的比例 . 盡量使 k’= 1 – 10， 最好使 k’= 2 – 10， k’值小于 2，分離度不夠 k’值大于 10，會擴(kuò)展運(yùn)行時間 峰加寬 (1) 靈敏度變小 (2) 定量準(zhǔn)確性變差 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 2 4 6 8 10 k’ Rs 1 20 2 10 怎樣改善 k’ 甲醇 / 乙腈 / THF 1) 與水易于混和 2) UV 可以透過 3) 低粘度 4) 極性有差異 與甲醇相比，乙腈有以下優(yōu)點 1) 操作壓力更低 2) 洗脫能力稍高 3) 在低波長范圍內(nèi)可以應(yīng)用 (185205nm) 選擇乙腈更好 . 然而 , 由于價格因素和 ANC的毒性，甲醇仍然是首選 溶劑的選擇 溶劑最優(yōu)化 甲醇 /水混合物做流動相 樣品組成 : 硝基苯 , 苯 , 2,6二硝基甲苯 2硝基甲苯 , 4硝基甲苯 , 3硝基甲苯 ,甲苯 , 2硝基 1,3二甲苯 4硝基 1,3二甲苯 , m二甲苯 100% MeOH K’ 80% MeOH K’ 溶劑最優(yōu)化 ODS 柱 樣品組分 Peak 1: nitorbenzene Peak 2: benzene Peak 3: 2,6dinitrotoluene Peak 4: 2nitrotoluene Peak 5: 4nitrotoluen