rnai及其在抗hiv中的初步應(yīng)用-資料下載頁(yè)
2025-04-30 08:31本頁(yè)面
【正文】 素會(huì)在穿透的細(xì)胞中積累毒素。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在 siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)需要無血清的條件。這種情況下，可同時(shí)用正常培養(yǎng)基和 無血清培養(yǎng)基 做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，需要注意問題 ? ? 針對(duì) siRNA制備方法以及靶細(xì)胞類型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對(duì) siRNA實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，需要注意問題 ? 條件 ? 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞，看家基因是較好的陽(yáng)性對(duì)照。將不同濃度的陽(yáng)性對(duì)照的 siRNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞（同樣適合實(shí)驗(yàn)靶 siRNA），轉(zhuǎn)染 48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)對(duì)照蛋白或 mRNA相對(duì)于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。過多的siRNA將導(dǎo)致細(xì)胞毒性以至死亡。 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，需要注意問題 ? siRNA來優(yōu)化實(shí)驗(yàn) ? 熒光標(biāo)記的 siRNA能用來分析 siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標(biāo)記的 siRNA還可用作 siRNA胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（配合標(biāo)記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導(dǎo)入了 siRNA的細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達(dá)的下調(diào)結(jié)合起來。 RNAi的應(yīng)用前景 ?1. 研究基因功能的新工具 ? RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中滅活或降低特異性基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。 ? 與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比， RNAi有投入少，周期短，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì) ? 近來 RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的報(bào)道日益增多，標(biāo)志著 RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。 RNAi的應(yīng)用前景 ?2. 研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑 ? 聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和 RNAi技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系。 ? Clemensy等應(yīng)用 RNAi研究了果蠅細(xì)胞系中胰島素信息傳導(dǎo)途徑 ,取得了與已知胰島素信息傳導(dǎo)通路完全一致的結(jié)果 , 在此基礎(chǔ)上分析了DSH3PX1與 DACK之間的關(guān)系。 ? 證實(shí)了 DACK是位于 DSH3PX1磷酸化的上游激酶 . ? RNAi技術(shù)將可能成為研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑。 RNAi的應(yīng)用前景 ? ?RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)，防止某些基因序列過量增殖等作用。 ?因此可以利用 RNAi現(xiàn)象產(chǎn)生抗病毒的植物和動(dòng)物，并可利用 不同病毒轉(zhuǎn)錄序列中高度同源區(qū)段 相應(yīng)的 dsRNA抵抗多種病毒。 RNAi的應(yīng)用前景 ? ? 腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長(zhǎng) , ? RNAi可以利用同一基因家族的 多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列 這一特性 , 設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的 dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表現(xiàn)。 ? 也可以同時(shí)注射 多種 dsRNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。 RNAi的應(yīng)用前景 ?目前 RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用還處于探索階段。 ?但它在斑馬魚和老鼠等脊椎動(dòng)物中的成功應(yīng)用預(yù)示著 RNAi將成為基因治療中重要的組成部分。 ?人工合成的 dsRNA寡聚藥物的開發(fā)將可能成為極具發(fā)展前途的新興產(chǎn)業(yè)。 SuperArray siRNA 陣列板 ? Superarray siRNA陣列板中皆已包被有效 siRNA和轉(zhuǎn)染試劑。實(shí)驗(yàn)時(shí)，直接加入細(xì)胞及培養(yǎng)基，板上包被的轉(zhuǎn)染試劑和 siRNA溶于細(xì)胞培養(yǎng)基中，隨之 siRNA自動(dòng)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中， AIDS治療 ?迄今為止 ,尚沒有能使艾滋病痊愈的藥物 。幾種公認(rèn)的能夠抑制和延緩艾滋病發(fā)展進(jìn)程 , 雞尾酒療法在短期內(nèi)有一定療效 , 但有 很多缺點(diǎn) : ?① 不能治愈艾滋病 。 ?② 均有嚴(yán)重的毒副作用 。 ?③ 藥價(jià)昂貴 。 ?④ 很容易出現(xiàn)耐 藥毒株。 RNA i 抑制 H IV1 感染的策略 ?根據(jù) H IV1 感染的途徑 ?受體 CD4 ?配體 CCR CXCR4 ?整合后轉(zhuǎn)錄翻譯等環(huán)節(jié) ? Jacque 等人針對(duì) H IV1 復(fù)制的早期和晚期 , 設(shè)計(jì)針對(duì) H IV1 基因組不同區(qū)域的 siRNA s ? (LTR, 輔助基因 vif、 nef) , 并轉(zhuǎn)染人類細(xì)胞系以及原始淋巴細(xì)胞、 CD4+ HeL a 細(xì)胞。 ? 結(jié)果表明合成的 siRNA s 以及質(zhì)粒來源的 iRNA s 能夠通過特異性地降解 H IV1 RNA 來抑制 H IV1 感染 , 從而阻止病毒 cDNA 中間物的形成。 si RN As f ro m pl as m idtem pl at es ca n in hi bi t H IV 1P l asm i d e x pr e ssio n un de r T7 RNA pol . pr o m o te r of se l f c o m pl e m e nt ar y RNA 。 r e sult s i n ds RNA“ hai r pi n ”ALL su p p res se d v ira l p rod u cti o n 2 0 30xF i g . 3 H I V P ape r?Novina 等合成分別針對(duì) H IV1 細(xì)胞受體 ?CD 病毒結(jié)構(gòu)蛋白 Gag 基因 siRNA s, ?發(fā)現(xiàn) siRNAs 能夠有效抑制 H IV1 進(jìn)入細(xì)胞、 H IV1 生活周期的整合前和整合后感染 , Intr od uce d 22 n uc l eotide s y nthetic si R N A s ( ple m entar y to H IV target +/ G F P ) i n to h um a n cell l ines/ prim ar y l y m ph oc y t esR E S U LTS : DO N O T AC TIV ATE P K R P ATH W AYandsiRNA s S P ECIF I CALLY DEG RAD E H IV 1 m RNA ,d sRNA act iv at ed p rot ein k i n aseG en om ic H IV 1 RN Ain NU CL E O PR O T E IN CO MP L E X E Sis su bje ct t o sp ec if ic RN Ai d eg ra da tio nF i g .2 H iV pape rsiRNA治療 HIV存在的問題 ?siRNA設(shè)計(jì)上的有效性 ： 1個(gè) bp的變化就能顯著影響 , 逆轉(zhuǎn)錄的高錯(cuò)誤率（復(fù)制過程中有 1/1000發(fā)生突變） ?siRNA導(dǎo)入細(xì)胞的效率 ?siRNA穩(wěn)定性的問題 ：容易被細(xì)胞內(nèi)的RNA酶降解。 DNA質(zhì)粒 和編碼 siRNA的病毒載體成功地提高了 siRNA穩(wěn)定性。但是載體安全性問題 仍是難題！
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