色層分析法ppt課件(2)-資料下載頁(yè)
2025-04-29 03:43本頁(yè)面
【正文】 同，在層析柱內(nèi)所經(jīng)過的 時(shí)間和路程長(zhǎng)短 不同，從而使樣品分子大小不同的物質(zhì)得到分離 。Date 93n 凝膠裝柱后，柱床容積（ Vt） 可分為三個(gè)組分，即： Vt=Vo+Vi+Vg Vo 為外容積柱床內(nèi)凝膠顆粒之間液體的體積，相當(dāng)于一般層析法中柱內(nèi)流動(dòng)相容積； Vi 為內(nèi)容積，即凝膠顆粒內(nèi)部所含的液體體積，相當(dāng)于一般層析法中的固定相容積； Vg 為凝膠顆粒本身的體積。 Date 94n 每個(gè)溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相之間有一個(gè)特定的分配系數(shù) Kd,則它的洗脫體積 Ve為： Ve=Vo+KdVi Date 95Kd可有下列幾種情況： n 當(dāng) Kd=0時(shí)， Ve=Vo,即溶質(zhì)分子完全不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，完全被排阻于凝膠顆粒微孔之外而最先洗脫下來。n 當(dāng) Kd=1時(shí)， Ve=Vo+Vi， 即溶質(zhì)分子完全滲入凝膠內(nèi)部，在洗脫過程中將最后流出柱外。n 當(dāng) 0Kd1時(shí) , Ve=Vo+KdVi， 即溶質(zhì)分子以某種程度向凝膠顆粒內(nèi)擴(kuò)散， Kd愈大，進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)的程度愈大，此時(shí) Ve在 Vo與 Vo+Vi之間變化。n 一般情況下，凝膠對(duì)組分沒有吸附作用，有時(shí)Kd1,即凝膠對(duì)組分有吸附作用，此時(shí) VeVo+Vi，如苯丙氨在 SephadexG25中的 Kd值為１ .2。 Date 96n 可以看出，對(duì)某一凝膠介質(zhì)，兩種全排出的分子即 Kd都等于零，雖然分子大小有差別，但不能有分離效果。同樣，兩種分子如都能進(jìn)入內(nèi)部空隙，即都等于 1，它們即使分子大小有不同，也沒有分離效果。因此不同型號(hào)的凝膠介質(zhì)，有它一定的使用范圍。n 上式中總床體積 Vt， 可由圓柱形層析柱的體積計(jì)算 （ V= ） ,而外體積 Vo的測(cè)定，可采用一個(gè)分子量遠(yuǎn)超過凝膠排阻極限的有色大分子的溶液通過色譜床，其洗脫體積就等于 Vo， 最常用的參照物為分子量約 200萬(wàn)的藍(lán)色葡聚糖 2022。n Vi可由 Wg求得， g為干凝膠重 (g)， WR為凝膠的吸水量(ml/g)， 或選用一個(gè)自由擴(kuò)散的小分子通過色譜床，此時(shí)Kd=1，則 Vi=VeVo。 Date 97n 在實(shí)際工作中對(duì)小分子物質(zhì)也得不到 Kd=1的數(shù)值， Vi不易正確測(cè)定，故把整個(gè)凝膠都作為固定相，則分配系數(shù) Kav定義如下： Ve=Vo+ Kav(VtVo)Date 982 ． 凝膠層析的基本概念（ 1）得水率（ water regain,Wr） 1克凝膠吸收水的克數(shù)稱為得水率。 如 Sephadex G100， 型號(hào)后的數(shù)字表示凝膠的得水率乘以 10，其得水率為 10，即1克 G100干凝膠膨化時(shí)能吸收 10克水。這個(gè)數(shù)值只表示吸進(jìn)凝膠顆粒內(nèi)部的水分，不包括凝膠顆粒周圍的水分。Date 99 排阻極限是指不能擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi)部的最小溶質(zhì)分子的分子量。 如典型的葡聚糖凝膠 Sephadex G75， 排阻限度為 7*104道爾頓，樣品混合物中凡是分子量大于 7*104道爾頓的化合物分子在這種凝膠上層析時(shí)就得不到有效的分離。（ 2）排阻極限（ exclusion limit）Date 100n 使溶質(zhì)分子在某種凝膠中得到很理想的線性分離的范圍就稱為這種 凝膠的分級(jí)分離范圍 （ Fractionation rage）。n 如 Sephadex G50， 分級(jí)分離范圍為**104道爾頓。 Date 1013 ．凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) n 天然的和人工合成的凝膠種類很多，但是能夠用于凝膠層析的種類很少。用于層析的凝膠必須具備下列條件： n 凝膠是惰性的。n 凝膠的化學(xué)性質(zhì)是穩(wěn)定的。 n 凝膠上沒有或只有極少量的離子交換基團(tuán)以避免離子交換效應(yīng) 。n 凝膠上必須具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，防止在液流作用下變形。 Date 102凝膠層析中，常用的四種凝膠是n 葡聚糖（ dextramnel） 凝膠 ；n 聚丙稀酰胺凝膠（ polyacrylamine gel）；n 瓊脂糖凝膠（ agarose gel）；n 瓊脂糖及葡聚糖組成的復(fù)合凝膠 。 Date 103（ 1）葡聚糖凝膠n 葡聚糖凝膠是由葡聚糖與環(huán)氧化氯丙烷通過交聯(lián)反應(yīng)形成的三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。n 葡聚糖凝膠在水、鹽溶液、有機(jī)溶液、堿溶液和弱酸溶液中都不溶而性質(zhì)穩(wěn)定。強(qiáng)酸溶液中其糖苷鍵易水解。n 不能和氧化劑并用，因?yàn)檠趸瘎┐嬖谙?，易使羥基氧化成羧基而增加離子電荷，從而影響層析特性。n 層析之后只要防止微生物生長(zhǎng)，葡聚糖凝膠可反復(fù)使用多次，一般可在 100oC煮沸 40min消毒。Date 104n 一般情況下， 超細(xì)顆粒 約 400篩目，顆粒直徑在 10~40um之間，用于要求分辨率十分高的柱層析中；n 細(xì)顆粒 約 100～ 200篩目，直徑在 50～150um之間，用于制備目的；n 中等和粗顆粒 在 50～ 100篩目之間，直徑約在 100～ 300um,則用于低操作壓下高流速的制備柱層析。（ 1）葡聚糖凝膠Date 105（ 2）聚丙稀酰胺凝膠n 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’ 次甲基雙丙烯酰胺共價(jià)聚合而成的。n 商品名稱為 BioGel P， P后面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠的排阻極限，單位是 *103道爾頓。n 聚丙烯酰胺凝膠和葡萄糖凝膠在層析性質(zhì)和吸附性能上極其相似，在 pH110的緩沖液內(nèi)，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均不發(fā)生明顯的變化。 Date 106（ 3）瓊脂糖凝膠 n 瓊脂是海藻制得的天然多聚糖，瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來的天然凝膠，是由D— 半乳糖（ D— galactose）和 3,6— 脫水半乳糖 (anhydrogalactose)交替構(gòu)成的多聚糖。n 瓊脂糖制成的這種凝膠，由于分子內(nèi)和分子間氫鍵，使得凝膠結(jié)構(gòu)具有較大的穩(wěn)定性。n 同時(shí)，此凝膠具有很高的排阻極限，適于分離較大的大分子化合物， 常用于病毒、核酸及多聚糖的分離分析 。 Date 107n 在以水為溶劑的緩沖液、高濃度鹽溶液及乙醇中，其結(jié)構(gòu)和性能均不受影響，一般操作溫度在 030℃ 。n 它的商品名因生產(chǎn)廠家不同而異，目前有Sepharose(瑞典的 pharmacia公司 )2B、 4B、 6B， 阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分含量；n Bio— GelA(美國(guó)的 Bio— Rad laboratories公司 )有六種型號(hào)，即 Bio—Gel ， ， 5M， 15M， 50M和 150M， 阿拉伯?dāng)?shù)字乘以 106表示排阻度；（ 3）瓊脂糖凝膠 Date 108n Sagavac(英國(guó) )2F， 4F， 6F， 8F， 10F和 2C， 4C， 6C， 8C， 10C， 阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分?jǐn)?shù)， F代表粉末狀， C代表膠粒狀； Gelarose(丹麥 )2%， 4%， 6%， 8%， 10%，百分?jǐn)?shù)代表干膠量。n 這類凝膠商品常懸浮于 %的疊氮化鈉水溶液中。 （ 3）瓊脂糖凝膠 Date 109
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