【正文】 高? 在基因組中均勻分布? 具有中性選擇特征? 容易獲得而且可快速分析? 重復性好? 分離標記所需的費用低? DNA標記多態(tài)性的分子基礎 分子標記多態(tài)性的原理? （一）酶切位點或引物結合位點的變化? （二）酶切位點或引物結合位點之間的插入突變? （三）酶切位點或引物結合位點之間的缺失突變? （四）酶切位點或引物結合位點之間的重復序列的重復次數(shù)的變化? （五）單個核苷酸的突變遺傳圖譜的構建所用的各種群體一、遺傳連鎖圖構建的基礎 ? 構建遺傳圖譜的依據(jù)是同源染色體減數(shù)分裂過程中會發(fā)生交換，交換的結果便使染色體上的基因發(fā)生重組? 兩個基因之間發(fā)生重組的頻率取決于它們之間的相對距離? 基因間的遺傳距離用重組率表示，1 cM≈1％的重組率 作圖群體分類? 暫時性分離群體：回交群體、F2群體以及其衍生群體如F2:3等? 永久性分離群體：重組自交系群體(Rebinant inbred lines，RIL)，加倍單倍體群體(Doubled haploid，DH)等? RIL群體是由F2經(jīng)多代自交一粒傳(Single seed descendant，簡稱SSD)使后代基因組相對純合的群體? 永久性群體有兩方面特點：? 群體中各品系的遺傳組成相對固定，可通過種子繁殖代代相傳，可不斷地增加新的遺傳標記? 可以對性狀的鑒定進行重復試驗以得到更為可信的結果? 建立RIL群體相當費時，而且有的物種很難產生RIL群體 分子標記的類型（中英文全稱及簡稱）① 基于DNADNA雜交 RFLP② 基于PCR ISSR, SSR, RAPD,SRAP…③ 基于PCR和RE酶切 AFLP④ 基于DNA測序 SNP，EST， Retrotransposon一、 基于分子雜交技術的分子標記Molecular Hybridization (核酸分子雜交)： 不同來源的單鏈DNA與單鏈DNA間，在長于20bp的同源區(qū)域內，以氫鍵連接方式互補配對，形成穩(wěn)定的雙鏈結構的過程基于DNADNA雜交（southern blotting) 的標記– RFLP:Restriction Fragment Length Polymorphism (限制性片段長度多態(tài)性標記）– VNTR:Variable Number Tandem Repeats (minisatellites)（可變數(shù)目串聯(lián)重復序列標記） 二、基于PCR技術的分子標記? 短核苷酸序列引物? 耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）擴增目標DNA序列? 快捷、簡易、靈敏等優(yōu)點? RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA （隨機擴增多態(tài)性）? SSR: Simple Sequence Repeats (Microsatellites) （簡單重復序列）? ISSR: Intersimple sequence repeat （簡單序列重復間區(qū)）? SCAR: Sequence Characterized Amplified Region（序列特征化擴增）? STS: Sequence Tagged Sites （序列標簽位點）三、基于PCR與限制性酶切技術結合的標記AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphisms（擴增片段長度多態(tài)性）CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequences（擴增片段限制性酶切長度多態(tài)性）PCR反應的主要步驟和組分（課本317）? PCR反應組分：DNA模板 一對引物 dNTP Taq酶 Mg 2+ 反應緩沖液 ddH2OAFLP技術的步驟限制性內切酶酶切? 一般應用兩種限制性內切酶在適宜的緩沖系統(tǒng)中對基因組DNA 進行酶切，一種為低頻剪切酶(識別位點為六堿基的rare cutter) ，另一種為高頻剪切酶(識別位點為四堿基的frequent cutter) ? 利用雙酶切可產生更好的擴增反應，在凝膠上產生適宜大小的適于分離的片段，不同的內切酶組合及選擇性堿基的數(shù)目和種類可靈活調整片段的數(shù)目，從而產生不同的AFLP指紋? 酶切片段要經(jīng)過連續(xù)2次PCR 擴增，通過這樣兩步擴增反應使產生的擴增結果更清楚、重復性更好? 第1次PCR 擴增被稱為預擴增反應(Preamplification)，所用的AFLP引物只含有1個選擇性核苷酸，選擇擴增性能較差，因此大量的擴增產物在凝膠中往往形成連續(xù)的一片? 預擴增反應條件與常規(guī)PCR反應條件大致相同AFLP接頭? 是一種人工合成的雙鏈DNA , 一般長度是14～18個核苷酸, 由核心順序和內切酶位點特異順序兩部分組成? 在絕大多數(shù)真核生物基因組DNA中，EcoRI總是給予可靠的酶切結果，價格又便宜，而MseI可以產生比較小而穩(wěn)定的酶切片段。因此，目前商品出售的AFLP試劑盒中用的是EcoRI接頭和MI seI接頭AFLP引物? 是一種人工合成的單鏈寡核苷酸，一般長度為 1820個核苷酸，由核心順序 (core)、內切酶位點特異順序 (ENZ)和選擇性核苷酸順序(EXT)三部分組成? AFLP引物除了含有能與接頭及酶切位點相互補的序列外，其3’末端還填加有13個選擇性核苷酸順序擴增產物的凝膠電泳分析選擇性擴增產物一般在5%～ 6% 的變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE序列分析膠)上經(jīng)過電泳分離，形成DNA指紋，凝膠經(jīng)過干燥、放射性自顯影后即可進行結果分析? 優(yōu)點：– 信息量大? 缺點：– 要求質量高的DNA– 操作繁瑣，條件優(yōu)化較難– 染色體聚集質量性狀和數(shù)量性狀基因定位的方法? 質量性狀：? 近等基因系分析法? 分離集團混合分析法 – 1. 基于性狀表現(xiàn)型的BSA法– 2. 基于標記基因型的BSA法 – 3. 極端集團隱性群法數(shù)量性狀基因的定位? 連續(xù)變異? 數(shù)量性狀受微效多基因控制(Quantitative trait loci, QTL)? 對外界環(huán)境變化比較敏感? 需要統(tǒng)計分析如何定位QTL？QTL作圖方法1. 單標記分析2. 區(qū)間定位法復合區(qū)間定位法（posite interval mapping，CIM）分子標記輔助選擇的優(yōu)勢克服性狀鑒定的困難隱性等位基因 表現(xiàn)型鑒定難 需要特別環(huán)境鑒定允許早期選擇，多性狀/基因選擇顯著地減輕連鎖累贅的程度加快育種進程，提高育種效率免除了測交或后代測驗 早世代選擇，減少群體規(guī)模全基因組選擇第十章RNA干涉：RNA干涉，是近年來發(fā)現(xiàn)的在生物體內普遍存在的一種古老的生物學現(xiàn)象，是由雙鏈RNA（dsRNA）介導的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象,它在轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達基因組測序及序列組裝的方法（2種）? 依據(jù)基因組的物理圖譜，將重疊群的各個克隆分別進行序列測定、拼接，再完成各重疊群的序列拼接，最后完成全基因組的序列圖譜“全基因組散彈法”策略：構建插入片段約為1～3kb的全基因組DNA文庫，隨機挑選一定數(shù)量的克隆進行兩端序列測定，再通過計算機軟件分析進行序列比較、去除和拼接，最后完成全基因組的序列圖譜 鳥槍法的順序組裝是直接從已測序的小片段中尋找彼此重疊的測序克隆，然后依次向兩側鄰接的序列延伸。這一方法不需要預先了解任何基因組的情況，即使缺少遺傳圖譜和物理圖譜，也可以完成整個基因組的組裝。? 優(yōu)點:不需預先了解任何基因組的情況。? 缺點：不適合大基因組測序。DNA測序的兩種方法： 鏈終止法（the chain termination method） 單鏈DNA分子的序列由與之互補的多核苷酸鏈的酶促合成來判定，互補鏈在某一特定的核苷酸位置終止。 化學降解法（chemical degradation method）雙鏈DNA分子被化學物質修飾后，在特定核苷酸位置被切開，從而確定DNA分子的序列。哪些物種可以進行比較基因組測序一、比較基因組學(Comparative Genomics) 概念：是基于基因組圖譜和測序基礎上，對已知的基因和基因組結構進行比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學科。 ? 茄科植物基因組含有相同的12條染色體，而其單倍體的DNA含量差異很大禾本科植物? 10,000多個種 不同的染色體基數(shù)，單倍體DNA含量差異巨大 共線性程度高，重排現(xiàn)象普遍 異源6倍體的普通小麥 ABD 玉米與高粱 小麥、黑麥和大麥 水稻和玉米 蕓薹屬植物? 6個種具有不同的染色體數(shù)目? 有性雜交和細胞學鑒定：– 甘藍、黑芥和蕓薹3個種屬于2倍體– 甘藍型油菜、芥菜和埃塞俄比亞芥(3個種屬于4倍體? 分子連鎖圖存在同線性 模式植物擬南芥與其它植物的比較基因組研究? 十字花科：蕓薹屬和擬南芥? 雙子葉植物 ：大豆、西紅柿和擬南芥 基因組測序的方法（應用）19 /