【正文】 ①產(chǎn)毒培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。加入20000IU／，于37℃培養(yǎng)1h，4000r／min離心15min，分離上清液，％，于4℃保存待用。②LT檢測方法(雙抗體夾心法)包被：先在產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏菌CT和ST酶標(biāo)診斷試劑盒中取出包被用LT抗體管，，以每孔100μl量加入到40孔聚苯乙烯硬反應(yīng)板中，第一孔留空作對照，于4℃冰箱濕盒中過夜。洗板：將板中溶液甩去，用洗滌液I洗3次，甩盡液體，翻轉(zhuǎn)反應(yīng)板，在吸水紙上拍打，去盡孔中殘留液體。封閉：每孔加100μL封閉液，于37℃水浴中l(wèi)h。洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。加樣本：每孔分別加多種試驗(yàn)菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)液100μl，37℃水浴中l(wèi)h。洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。加酶標(biāo)抗體：，每孔加100μl，37℃水浴中1h。洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。酶底物反應(yīng)：每孔(包括第一孔)各加基質(zhì)液100μl，室溫下避光作用5min~10min，加入終液50μl。結(jié)果判定：以酶標(biāo)儀在波長492nm下測定吸光度0D值，待測標(biāo)本OD值大于陰性對照3倍以上為陽性，目測顏色為桶黃色或明顯高于陰性對照為陽性。③ST檢測方法(抗原競爭法)包被：，混勻后全部吸出于1.6ml包被液中混勻，以每孔50μl加入于40孔聚苯乙烯軟反應(yīng)板中。加液后輕輕敲板，使液體布滿孔底。第一孔留空作對照，置4℃冰箱濕盒中過夜。洗板：用洗滌液I洗3次，操作同上。封閉：每孔加100μl封閉液，37℃水浴比。洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。加樣本及ST單克隆抗體：每孔分別加各試驗(yàn)菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)液50μl、稀釋的ST單克隆抗體50μl(，混合)，37℃水浴1h。洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。加酶標(biāo)記兔抗鼠1g復(fù)合物：，每孔加100μl，37℃水浴1h。洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。酶底板反應(yīng)：每孔(包括第一孔)各加基質(zhì)液100μl，室溫下避光5min~10min，再加入終止液50μl。結(jié)果判定：以酶標(biāo)儀在波長492nm下測定吸光度OD值；目測無色或明顯淡于陰性對照為陽性。（2）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測LT將被檢菌株按五點(diǎn)環(huán)形接種于E1ek氏培養(yǎng)基上。以同樣操作，共做兩份，于36℃培養(yǎng)48h。在每株菌苔上放多粘菌素B紙片，于36℃經(jīng)5h～6h，使腸毒素滲入瓊脂中，在距五點(diǎn)環(huán)形菌苔各5mm處的中央，挖一個(gè)直徑4mm的圓孔，并用一滴瓊脂墊底。在平板的中央孔內(nèi)滴加LT抗毒素30μl，用已知產(chǎn)LT和不產(chǎn)毒菌作對照，經(jīng)15h～20h觀察結(jié)果。在菌斑和抗毒素孔之間出現(xiàn)白色沉淀帶者為陽性，無沉淀帶者為陰性。（3）乳鼠灌胃試驗(yàn)檢測ST將被檢菌株接種于Honda氏產(chǎn)毒肉湯內(nèi)，于36℃培養(yǎng)24h，以3000r／min離心30min，取上清液經(jīng)薄膜濾器過濾，加熱60℃30min，每mL濾液內(nèi)加入2％。，同時(shí)接種3只～4只，禁食3h～4h后用三氯甲烷麻醉，取出全部腸管，稱量腸管(包括積液)重量及剩余體重。，—。五、結(jié)果通過實(shí)驗(yàn)，有否檢出致病性大腸艾希氏菌？綜合以上生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)、腸毒素試驗(yàn)作出報(bào)告六、思考題致病性大腸艾希氏菌有哪幾種?主要引起哪幾種癥狀的疾病?怎樣預(yù)防致病性大腸艾希氏菌引起的食物中毒?致病性大腸艾希氏菌的檢驗(yàn)程序。附：本實(shí)驗(yàn)冊相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基和試劑營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白陳 10g牛肉育 3g氯化鈉 5g瓊脂 1520g蒸餾水 1000mL制法： 將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入15％氫氧化鈉溶液約2mL校正pH至，加入瓊脂，加熱煮沸使瓊脂溶化，分裝于燒瓶內(nèi)，121℃高壓滅菌15min。 注:此培養(yǎng)基可供一般細(xì)菌培養(yǎng)之用，可傾注平板或制成斜面。如用于菌落計(jì)數(shù)，％；如作成平板或斜面，則應(yīng)為2％。乳糖膽鹽發(fā)酵管成分：蛋白胨 10g豬膽鹽(或牛、羊膽鹽) 5g乳糖 10g％溴甲酚紫水溶液 24mL蒸餾水 1000mL制法：將蛋白陳、膽鹽及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示劑，分裝每管10mL，并放入一個(gè)小倒管，115℃高壓滅菌15min。注：雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。乳糖發(fā)酵管成分：蛋白胨 20g乳糖 10g蒸餾水 1000mL％溴甲酚紫水溶液 25mL制法： 將蛋白陳及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示劑，按檢驗(yàn)要求分裝每管30mL、10mL或3mL，并放入一個(gè)小倒管，115℃高壓滅菌15min。 注：①雙料乳糖發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。②30mL和l0mL乳糖發(fā)酵管專供醬油及醬類檢驗(yàn)用，3mL乳糖發(fā)酵管供大腸菌群證實(shí)試驗(yàn)用。麥康凱瓊脂成分：蛋白胨 17g朊胨 3g豬膽鹽(或牛、羊膽鹽) 5g氯化鈉 5g瓊脂 17g蒸餾水 1000mL乳糖 10g％結(jié)晶紫水溶液 10mL%中性紅水溶液 5mL制法：①將蛋白胨、朊胨、膽鹽和氧化鈉溶解于400mL蒸餾水中，將瓊脂加入600mL蒸餾水中，加熱溶解，將兩液合并，分裝于燒瓶內(nèi)，121℃高壓滅菌15min備用。②臨用時(shí)加熱熔化瓊脂，趁熱加入乳糖，冷至50℃一55℃時(shí)，加入結(jié)晶紫相中性紅水溶液，搖勻后傾注平板。結(jié)晶紫及中性紅水溶液配好后須經(jīng)高壓滅菌。伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)成分：蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氫二鉀 2g瓊脂 17g2％伊紅Y溶液 20mL％美藍(lán)溶液 10mL蒸餾水 1000mLpH 制法：將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸餾水中，校正pH，分裝于燒瓶內(nèi)，121℃高壓滅菌15min備用。臨用時(shí)加入乳糖并加熱溶化瓊脂，冷至50℃一55C，加入伊紅和美藍(lán)溶液，格搖勻，傾注平扳。三糖鐵瓊脂（TSI）成分：蛋白胨 20g牛肉膏 5g乳糖 10g蔗糖 10g葡萄糖 1g氯化鈉 5g硫酸亞鐵銨[Fe(NH4)2(SO4)26H2O] 硫代硫酸鈉 瓊脂 12g酚紅 蒸餾水 1000mL制法： 將除瓊脂和酌紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，校正pH，加入瓊脂，加熱煮沸，以溶化瓊脂，％，搖勻，分裝于試管內(nèi)，裝量宜多些，以便得到較高的底層。l21℃高壓滅菌15min，放置高層斜面?zhèn)溆??？耸想p糖鐵瓊脂（KI）上層培并基成分：血消化湯() 500mL瓊脂 硫代硫酸納 硫酸亞鐵銨 乳糖 5g％酚紅溶液 5mL下層培養(yǎng)基成分：血消化湯() 500mL瓊脂 2g葡萄糖 1g％酚紅镕液 5mL制法:①取血消化湯按上層和下層的瓊脂用量，分別加入瓊脂，加熱溶解。②分別加入其他各種成分。將上層培養(yǎng)基分裝于燒瓶內(nèi)；將下層培養(yǎng)茬分裝于滅菌12mm100mm試管內(nèi)，每管約2mL。115℃高壓滅菌10min。③將上層培養(yǎng)基放在56℃水浴箱內(nèi)保溫；將下層培養(yǎng)基直立放在室溫內(nèi)．使其凝固。④待下層培養(yǎng)基凝固后，以無菌操作將上層培養(yǎng)基分裝于下層培養(yǎng)基的上面，放成斜面。半固體瓊脂成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化鈉 5g瓊脂 4g蒸餾水 1000mL制法： 按以上成分配好，煮沸使溶解，（若瓊脂無雜質(zhì)可不過濾），分裝、包扎、標(biāo)記，121℃滅菌15min，取出直立凝固備用。 注：供動力觀察、菌種保存、H抗原位相變異等試驗(yàn)用。Honda氏產(chǎn)毒肉湯成分：水解酪蛋白 20g酵母浸膏粉 10g氯化鈉 磷酸氫二鈉 15g葡萄糖 5g微量元素 蒸餾水 1000mL制法：溶解后校正pH，121℃高壓滅菌15min，待冷卻至4550℃時(shí)，加入林可霉素溶液(每毫升培養(yǎng)基內(nèi)含90μg)。微量元素配方：硫酸鎂5g、氯化鈷2g、蒸餾水100mL。E1ek氏培養(yǎng)基(毒素測定用)成分：蛋白胨 20g麥芽糖 3g乳糖 氯化鈉 5g瓊脂 15g40％氫氧化鈉溶液 蒸餾水 1000mL制法:用500mL蒸餾水溶解瓊脂以外的成分，煮沸，并用濾紙過濾，用1moL/L氫氧化鈉校正pH；用另外500mL蒸餾水加熱溶解瓊脂，將兩液混合，分裝于試管內(nèi)，每管10mL或20mL，121℃高壓滅菌15min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，傾注平板。1腸道菌增菌液肉湯蛋白胨 10g牛膽鹽 20g葡萄糖 5g磷酸氫二鈉 8g磷酸二氫鉀 2g煌綠 蒸餾水 1000mL制法：將上述成分配好，加熱溶解，校正pH，分裝每瓶30mL在115℃高壓滅菌15min。1營養(yǎng)肉湯成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化鈉 5g蒸餾水 1000mL制法：按上述成分混合，溶解后校正pH，分裝燒瓶，每瓶225mL，121℃高壓滅菌15min。1糖發(fā)酵管(乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇)成分：牛肉膏 5g蛋白胨 10g氯化鈉 3g磷酸氫二鈉 2g%溴麝香草酚藍(lán)溶液 12mL蒸餾水 1000mL制法：葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后，%加入葡萄糖，分裝于有一個(gè)倒置的小試管內(nèi)，121℃高壓滅菌15min。其他各種糖發(fā)酵管可按上述分配好后，分裝每瓶100mL，121℃高壓滅菌15min。另將各種糖類分別配好10%溶液，同時(shí)高壓滅菌。用無菌吸管將5mL糖溶液加入于100mL培養(yǎng)基內(nèi)，以無菌操作分裝試管。實(shí)驗(yàn)方法：從瓊脂斜面上挑取小量培養(yǎng)物接種，于36177。1℃培養(yǎng)。一般觀察23天，遲緩反應(yīng)觀察1430天。1尿素瓊脂成分：蛋白胨 1g氯化鈉 5g葡萄糖 1g磷酸二氫鉀 2g瓊脂 20g%酚紅溶液 3mL20%尿素溶液 100mL蒸餾水 900mL177。1制法：將除尿素和瓊脂以外的成分配好，并校正pH，加入瓊脂，加熱溶化并分裝燒瓶。121℃高壓滅菌15min，冷至5055℃，加入經(jīng)除菌過濾的尿素溶液。尿素的最終濃度為2%，177。1，分裝于滅菌試管內(nèi)，放斜面?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)方法：挑取瓊脂培養(yǎng)物接種，在36177。1℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。尿素酶陽性者由于產(chǎn)堿而使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色1氰化鉀培養(yǎng)基成分：蛋白胨 10g氯化鈉 5g磷酸二氫鉀 磷酸氫二鈉 瓊脂 20g%氰化鉀溶液 20mL蒸餾水 1000mL制法：將除氰化鉀以外的成分配好后分裝燒瓶，121℃高壓滅菌 15 分鐘放在冰箱內(nèi)使其充分冷卻，% （最后濃度為 1：1000）,分裝于12 x100mm 滅菌試管。每管約4mL, 立即用滅菌橡皮塞塞緊,放在4℃冰箱內(nèi), 至少可保存兩個(gè)月。同時(shí), 將不加氰化鉀的培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基,分裝試管備用。試驗(yàn)方法: 將瓊脂培養(yǎng)物接種于蛋白陳水內(nèi)成為稀釋菌液,挑取一環(huán)接種于KCN培養(yǎng)基, 并另挑取一環(huán)接種于對照培養(yǎng)基。于36士1℃培養(yǎng)12天, 觀察結(jié)果。如有細(xì)菌生長即為陽性(不抑制),經(jīng)2天細(xì)菌不生長為陰性（抑制）?！醋ⅰ登杌浭莿《舅幬?使用時(shí)應(yīng)小心, 以免中毒, 夏天分裝培養(yǎng)基應(yīng)在冰箱內(nèi)進(jìn)行。 試驗(yàn)失敗的原因主要是封口不嚴(yán), 氰化鉀還漸分解產(chǎn)生氫氨酸氣體逸出,以致藥物濃度降低細(xì)菌生長, 因而造成假陽性反應(yīng)。試驗(yàn)時(shí)對每一環(huán)節(jié)都要特別注意。1氧化酶試驗(yàn)試劑:1% 鹽酸二甲基對苯二胺溶液, 少量新鮮配制, 于冰箱內(nèi)避光保存。1%α一萘酚酒精溶液。試驗(yàn)方法 :取白色潔凈濾紙沾取菌落。加鹽酸二甲苯對二胺溶液一滴。陰性者呈現(xiàn)粉紅色, 并逐漸加深；再加α一萘酚溶液一滴。陽性者于半分鐘內(nèi)呈現(xiàn)鮮藍(lán)色。陰性于兩分鐘內(nèi)不變色。以毛細(xì)吸管吸取試劑, 直接滴加于菌落上, 其顯色反應(yīng)與以上相同。1靛基質(zhì)試劑柯凡克試劑：將5g對二甲氨苯甲醛溶解于 75mL 戊醇中。然后緩慢加入濃鹽酸 25mL。歐波試劑：將1g對二甲氨基苯甲醛溶解于95%乙醇95mL內(nèi)。然后緩慢加入濃鹽酸2OmL。試驗(yàn)方法：挑取小量培養(yǎng)物接種,在(36177。1)℃培養(yǎng)12d, 必要時(shí)可培養(yǎng)45d。加入柯凡克試劑約 , 輕搖試管,陽性者于試劑層呈深紅色；, 沿管壁流下,覆 蓋于培養(yǎng)液表面,陽性者于液面接觸處呈玫瑰紅色。注:蛋白胨應(yīng)含有豐富的色氨酸。每批蛋白胨買來后 , 應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可使用。44 / 4