westernblot問(wèn)題匯總-資料下載頁(yè)
2025-03-24 05:08本頁(yè)面
【正文】 電流的分流，不但影響電流的效率，而且還會(huì)使部分加樣孔的條帶歪曲。2） 制膠時(shí)最好最后加入AP，這樣可以避免偶然情況下不能馬上灌膠而導(dǎo)致膠的聚合，確認(rèn)所有的東西準(zhǔn)備齊全了，再最后加入AP，混合均勻后馬上灌膠。一定要使配膠的幾種溶液混合均勻，這是制得性質(zhì)均一的凝膠的前提。3 ）進(jìn)口的AP可以很快使膠凝聚。所以，AP的用量最好比書(shū)上推薦的用量少點(diǎn)，這樣可以使膠的溶液慢慢聚合，這更有利于形成均勻一致的凝膠。也不會(huì)使操作變得手忙腳亂。4） 有時(shí)候，梳子拉出以后，明明看不到加樣孔中有凝膠，但是就是加不進(jìn)去樣品，這主要是由于梳子與較大的那塊玻璃之間的縫隙中存留的制膠溶液凝聚后形成的很薄的一層凝膠造成的。由于很薄，當(dāng)梳子拉出后，它就會(huì)和玻璃分離，剛好將加樣孔的口封住了，如果用20ul的加樣器加樣的話(huà)，這層凝膠很容易將樣品堵在外面，只要將這層凝膠除去，就可以順利加樣了。如果用專(zhuān)門(mén)的微量進(jìn)樣器，不會(huì)存在這樣的問(wèn)題。5）薄膜原因可能是由于梳子和 slide的厚度不是十分一致，而這可能是無(wú)法避免的。除此之外，也有由于拔出梳子時(shí)候造成的堵塞現(xiàn)象，個(gè)人認(rèn)為，這樣的堵塞現(xiàn)象可以通過(guò)插入梳子時(shí)先用水（配置電泳緩沖液的水）濕潤(rùn)梳子的方法避免，這樣還有利于形成整齊的加樣孔。不管怎么做，一定要等膠完全聚合好了再拉出梳子。 如果孔的形狀變化了，扭曲了，肯定會(huì)導(dǎo)致條帶不一致，結(jié)果不好。6）wangjun2002274 主任的：加樣的時(shí)候也是用專(zhuān)門(mén)的微量進(jìn)樣器，是寧波出的，50ul容量，每次都是用20ul的上樣量。以前等膠干后拔出梳子，馬上用水沖洗進(jìn)樣孔，就是用的那種塑料瓶擠壓沖洗，薄膜就沒(méi)有了，注意不要用力過(guò)猛，如果膠還沒(méi)有完全凝，很可能導(dǎo)致進(jìn)樣孔不整齊，那么跑出來(lái)的條帶就有窄有寬了將變性的和不變性蛋白同時(shí)加樣，相同濃度的抗體反應(yīng)后，不變性的條帶也可見(jiàn)，但明顯較弱。其原因，查資料后認(rèn)為蛋白的某些抗原性被其天然的結(jié)構(gòu)所掩蓋，通過(guò)蛋白變性可使其抗原表位暴露。而且，現(xiàn)在的抗體都是用細(xì)菌表達(dá)的某段融合蛋白并且變性后來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清，與體內(nèi)真正的蛋白有區(qū)別的，因此需要通過(guò)煮沸來(lái)變性體內(nèi)蛋白，暴露需要的抗原部位。SDS主要為統(tǒng)一不同蛋白的電荷，去除其對(duì)電泳遷移率的影響。一抗孵育：分別與相應(yīng)的抗體（初次做建議按照試劑要求的最高濃度開(kāi)始，別舍不得，否則沒(méi)結(jié)果更難受），及內(nèi)參照抗體（βactin抗體1:10 000，這蛋白抗體效價(jià)特別高，所以預(yù)實(shí)驗(yàn)做一下一般會(huì)有陽(yáng)性結(jié)果，一旦沒(méi)條帶可以排除你的實(shí)驗(yàn)操作中的因素）于室溫溫育90min，4℃過(guò)夜，再次室溫溫育60min。抗體稀釋液為T(mén)BST（內(nèi)含1%的BSA）（其實(shí)直接室溫2h就夠了，背景老是太高放4度過(guò)夜有時(shí)候?qū)档捅尘靶Ч诲e(cuò)）。：室溫下以TBST液在平緩搖動(dòng)條件下漂洗3次以上，每次各5min。勤換液比延長(zhǎng)漂洗時(shí)間更有效。顯影定影完畢，要用自來(lái)水沖干凈膠片，不劃傷，晾干以后再收藏，很重要！否則粘糊糊的，很容易把你本來(lái)漂亮的條帶給破壞了，這里出岔子就功虧一簣了！配膠準(zhǔn)備：將玻璃板、梳子有清潔劑或稀酸泡洗，電泳裝置用水沖洗并晾干，亦可用酒精棉球擦洗灌膠面晾干
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