freepeople性欧美熟妇, 色戒完整版无删减158分钟hd, 无码精品国产vα在线观看DVD, 丰满少妇伦精品无码专区在线观看,艾栗栗与纹身男宾馆3p50分钟,国产AV片在线观看,黑人与美女高潮,18岁女RAPPERDISSSUBS,国产手机在机看影片

正文內(nèi)容

dnarna合成常見(jiàn)問(wèn)題解答-資料下載頁(yè)

2025-03-24 04:50本頁(yè)面
  

【正文】 更不易感光。TAMRA結(jié)合物比相應(yīng)的熒光素結(jié)合物更明亮。TAMRA也可被543 nm的綠色的HeNe激光有效的激發(fā),它很大程度上被用于分析儀器。TAMRA結(jié)合物不能很好的被568 nm用于很多共聚焦激光掃描(電子)顯微鏡ArKr混合氣體激光激發(fā)。539。 Cy3 及539。 Cy5修飾法: Cy3 和Cy5的最大吸收/激發(fā)波長(zhǎng)是550/570 nm和649/670 nm。間隔物(spacer)修飾法:包括了多種在寡核苷酸與后續(xù)連接標(biāo)記之間的間隔序列的亞磷酰胺的合并,在標(biāo)記物與寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交反應(yīng)時(shí),這種方法可能是很重要的。肌苷修飾法: 脫氧肌苷以這種穩(wěn)定性順序I:C I:A I:T=I:。包含肌苷的寡核苷酸借助PCR或探針雜交可用于檢測(cè)或分析不同的或相似的DNA序列。硫磷酰修飾法: 經(jīng)硫磷酰基化的寡核苷酸對(duì)核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶的降解有很好的抵抗作用,這種特性能增加反義寡核苷酸鏈在細(xì)胞內(nèi)的效果。我們可以依據(jù)用戶的需要,在寡核苷酸部分序列中用硫磷酰基置換核苷酸內(nèi)部的磷酸基(在磷酸基中用一個(gè)硫原子代替一個(gè)氧原子)。雙重修飾法(539。熒光素339。 Dabsyl amp。 539。熒光素鈉339。 TAMRA 修飾): 雙重標(biāo)記的寡核苷酸可在實(shí)時(shí)PCR中用來(lái)檢測(cè)DNA的擴(kuò)增。他們或者在反應(yīng)中裂開(kāi)(如TaqMan探針)或者在互補(bǔ)目的DNA存在的情況下經(jīng)歷一種構(gòu)型變化(如分子信標(biāo))。許多探針利用寡核苷酸形成反向環(huán)構(gòu)型的特征進(jìn)行設(shè)計(jì)。實(shí)際上,通過(guò)除去供體熒光基團(tuán)的淬滅作用,探針可指示反應(yīng)的發(fā)生。PCR檢測(cè)的539。 核酸酶測(cè)定法(TaqMan探針): 539。核酸酶測(cè)定法被用來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。這種測(cè)定法利用耐熱性DNA聚合酶的539。核酸外切酶的活性來(lái)檢測(cè)正在進(jìn)行的反應(yīng)。耐熱性DNA聚合酶能夠從鏈狀DNA的539。端水解核苷酸,舊鏈在合成一條新鏈時(shí)被置換。裂解主要發(fā)生在置換的單鏈部分和DNA配對(duì)的雙鏈部分的連接處。這導(dǎo)致單核苷酸和寡核苷酸從置換的DNA鏈的539。末端被釋放。DNA聚合酶的這種特性被用來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。在539。端核酸酶檢測(cè)法中FRET DNA雙重探針是短的寡核苷酸,與擴(kuò)增DNA靶序列和修飾的339。端互補(bǔ),以至于他們不能在339。端延長(zhǎng)。他們?cè)?39。和539。末端用熒光基團(tuán)標(biāo)記。報(bào)告熒光染料被放置在539。末端,粹滅劑被放置在探針的339。末端。在完整的探針中,染料的熒光性被消除,在PCR反應(yīng)中探針與靶序列雜交 ,借助耐熱性DNA聚合酶的539。核酸酶的活性,淬滅劑與報(bào)告基因分離,從而恢復(fù)報(bào)告基因的熒光性。兩個(gè)探針被使用,一個(gè)用于正常序列,另一個(gè)用于3 bp缺失的互補(bǔ)序列。每個(gè)探針在539。末端有不同的報(bào)告熒光,并且一個(gè)相同的粹滅劑染料連接在從539。末端數(shù)的第七個(gè)核苷酸上。靶DNA的鑒定由熒光發(fā)射光譜決定。分子信標(biāo): 嚴(yán)格的說(shuō),熒光淬滅在使用DABCYL分子指示標(biāo)中不是FRET相關(guān)的,因?yàn)樗荒軡M足重疊光譜的標(biāo)準(zhǔn)。然而,以FRET為基礎(chǔ)的淬滅也能被使用。分子信標(biāo)被作為雜交探針后不久被應(yīng)用于PCR,利用它們能夠同互補(bǔ)DNA雜交的原理,它們能夠被用來(lái)監(jiān)測(cè)一個(gè)正在進(jìn)行中的反應(yīng)和在實(shí)時(shí)PCR中區(qū)別等位基因。反應(yīng)完成后,反應(yīng)物加入固定有分子信標(biāo)的微量滴定孔中,借助讀取產(chǎn)生的熒光檢測(cè)產(chǎn)物?;蛘哌€可用封閉試管和實(shí)時(shí)程序來(lái)檢測(cè)。在這種情況下,分子信標(biāo)被直接加入到PCR混合物并且與擴(kuò)增反應(yīng)中新合成的DNA雜交。與TaqMan探針相比,分子信標(biāo)優(yōu)勢(shì)在于能夠進(jìn)行多重PCR檢測(cè),因?yàn)?,在理論上,他們能同時(shí)測(cè)定更多的產(chǎn)品?!26. 作為反義脫氧寡核苷酸的硫磷?;押塑账?↑TOP 隨著我們對(duì)分子生物學(xué)的理解不斷加深,我們慢慢獲得對(duì)分子水平疾病的認(rèn)識(shí)。合理的藥物設(shè)計(jì)變得更加可行。特別是在蛋白質(zhì)水平上分子間的反應(yīng)能夠被完美的設(shè)計(jì),通過(guò)生物合理的途徑來(lái)提高結(jié)合性,分子間的相互作用成功的被應(yīng)用和被最佳化。合成的脫氧寡核苷酸(ODNs)已經(jīng)被Zameik和Stephenson提出作為一種新的潛在的治療方法,這種方法以一種合理的方式與信使RNA疾病關(guān)聯(lián)蛋白相互作用,并且特異的抑制它的合成。 這種被稱為反義策略的方法的優(yōu)勢(shì)在于,通過(guò)眾所周知的WatsonCrick堿基配對(duì)法則,即單鏈核酸與互補(bǔ)的寡核苷酸鏈相互作用形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。每個(gè)蛋白分子均遵循分子生物學(xué)的基本機(jī)制合成:一個(gè)基因(雙鏈DNA)攜帶一種特定蛋白質(zhì)的遺傳信息,被轉(zhuǎn)錄成作為信息攜帶者的單鏈mRNA,再以此作為模板在核糖體指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成(翻譯)。因此,反義策略不被限制于特定類型的疾病而能夠被廣泛地應(yīng)用。天然的寡核苷酸(DNA和RNA)不能夠達(dá)到作為反義藥物候選物的標(biāo)準(zhǔn),不同的化學(xué)修飾將克服現(xiàn)存的障礙,它將被細(xì)胞吸收,抵抗核酸酶的降解和提高與mRNA的親和力。首先,脫氧寡核苷酸(ODNs)必須能夠穿越細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,ODNs就必須抵抗核酸酶的降解。最后,為了抑制致病基因的表達(dá),ODNs必須能夠特異性結(jié)合并對(duì)靶mRNA有高度的親和力。早期在組織培養(yǎng)中觀察到的ODNs的活性后曾認(rèn)為,這些理論上的障礙不值得擔(dān)心。然而,最近文章的數(shù)據(jù)分析顯示這些理論上的障礙確實(shí)存在。 最近的研究焦點(diǎn)在于用化學(xué)方法改善ODNs的特性,主要集中在核苷酸酶抵抗力和mRNA親和力的提高方面。mRNA親和力對(duì)于反義策略非常重要,它常常用解鏈溫度(Tm)所反映。雙倍體核酸中,由于堿基堆積產(chǎn)生的PP相互作用, 在260 nm紫外吸收被淬滅。加熱可將其退火解鏈成單鏈,導(dǎo)致其在260 nm處的紫外的吸收增加。因此,假定一個(gè)二狀態(tài)模型,會(huì)得到一個(gè)S形曲線,并能計(jì)算其熱力學(xué)參數(shù)。這個(gè)吸收溫度曲線的中點(diǎn)被定義為Tm,它反映的當(dāng)處于配對(duì)狀態(tài)的寡核苷酸鏈與處于單鏈狀態(tài)的寡核苷酸鏈達(dá)到平衡時(shí)的溫度。寡核苷酸的順序和長(zhǎng)度,適用下述的法則:Tm增加3到5癈粗略的等于締合常數(shù)增加十倍。寡核苷酸的修飾主要發(fā)生在磷酸二脂的骨架。核酸酶使寡核苷酸鏈快速降解的主要原因是磷酸二脂骨架結(jié)構(gòu)的水解,部分結(jié)構(gòu)替代已成為增強(qiáng)穩(wěn)定性的主要策略。此外,骨架修飾能影響寡核苷酸鏈的其他性質(zhì),如RNA親和力或細(xì)胞的吸收行為。 第一代的骨架修飾在硫磷酰中保留了磷原子。這個(gè)衍生性顯示對(duì)核酸酶具有不斷增長(zhǎng)的抵抗力。因此,相應(yīng)的寡核苷酸用于進(jìn)行體外或體內(nèi)試驗(yàn),但不幸的是,它們都顯示對(duì)靶RNA的低親和力。然而,硫磷酰被看作寡核苷酸第一代類似物,并顯示出抵抗不同靶分子的生物學(xué)活性。這種有力的行為主要?dú)w因于生物的或化學(xué)的穩(wěn)定性,良好的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性包括細(xì)胞的攝取以及對(duì)于這類化合物RNase H提高了裂解mRNA的能力。 硫磷酰主要是通過(guò)兩種不同的方式合成的:一種是在二氧化碳中溶解硫元素,或者借助更新的辦法,即使用Beaucage試劑( H1,2Benzodithiol1one1,1二氧化物)硫化亞磷酸三脂。后一種方法避免了硫元素在多數(shù)有機(jī)溶劑中不溶解以及二氧化碳毒性的問(wèn)題。Beaucage試劑也 生產(chǎn)高純度的硫磷酰。硫磷酰合成產(chǎn)生兩種同分異構(gòu)體(R和S),即對(duì)于一個(gè)長(zhǎng)度為n的寡核苷酸,在每一個(gè)合成位點(diǎn)產(chǎn)生2n1個(gè)二倍體非對(duì)映異構(gòu)體。最初,曾有關(guān)于這個(gè)同分異構(gòu)體的混合可能會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)知的結(jié)果的擔(dān)心。然而,幸運(yùn)的是,用任何標(biāo)準(zhǔn)S寡核苷酸制備同分異構(gòu)混合體不會(huì)出現(xiàn)影響生物學(xué)活性的寡核苷酸?!27. 怎樣制備雙鏈DNA? ↑TOP 把單鏈寡核苷酸制備成雙鏈DNA寡核苷酸,退火是最簡(jiǎn)單的方法,但要求要非常小心的移去不想要的單鏈材料。在STE緩沖液(10 mM TrisHCl , 50 nM NaCl, 1 mM EDTA)中溶解高濃度(110 OD260units/100 靗)的寡核苷酸混合兩種相同的濃度單鏈寡核苷酸。加熱到94癈然后緩慢冷卻至室溫。為了避免形成復(fù)雜的發(fā)夾結(jié)構(gòu),寡核苷酸需要更加緩慢的冷卻。雙鏈DNA終產(chǎn)品是穩(wěn)定的,建議貯存于4癈或冷凍環(huán)境。 20 /
點(diǎn)擊復(fù)制文檔內(nèi)容
試題試卷相關(guān)推薦
文庫(kù)吧 www.dybbs8.com
備案圖鄂ICP備17016276號(hào)-1