【正文】 更不易感光。TAMRA結(jié)合物比相應(yīng)的熒光素結(jié)合物更明亮。TAMRA也可被543 nm的綠色的HeNe激光有效的激發(fā)，它很大程度上被用于分析儀器。TAMRA結(jié)合物不能很好的被568 nm用于很多共聚焦激光掃描(電子)顯微鏡ArKr混合氣體激光激發(fā)。539。 Cy3 及539。 Cy5修飾法： Cy3 和Cy5的最大吸收/激發(fā)波長是550/570 nm和649/670 nm。間隔物(spacer)修飾法：包括了多種在寡核苷酸與后續(xù)連接標記之間的間隔序列的亞磷酰胺的合并，在標記物與寡核苷酸探針進行原位雜交反應(yīng)時，這種方法可能是很重要的。肌苷修飾法： 脫氧肌苷以這種穩(wěn)定性順序I:C I:A I:T=I:。包含肌苷的寡核苷酸借助PCR或探針雜交可用于檢測或分析不同的或相似的DNA序列。硫磷酰修飾法： 經(jīng)硫磷?；墓押塑账釋怂醿?nèi)切酶和核酸外切酶的降解有很好的抵抗作用，這種特性能增加反義寡核苷酸鏈在細胞內(nèi)的效果。我們可以依據(jù)用戶的需要，在寡核苷酸部分序列中用硫磷酰基置換核苷酸內(nèi)部的磷酸基(在磷酸基中用一個硫原子代替一個氧原子)。雙重修飾法(539。熒光素339。 Dabsyl amp。 539。熒光素鈉339。 TAMRA 修飾)： 雙重標記的寡核苷酸可在實時PCR中用來檢測DNA的擴增。他們或者在反應(yīng)中裂開(如TaqMan探針)或者在互補目的DNA存在的情況下經(jīng)歷一種構(gòu)型變化(如分子信標)。許多探針利用寡核苷酸形成反向環(huán)構(gòu)型的特征進行設(shè)計。實際上，通過除去供體熒光基團的淬滅作用，探針可指示反應(yīng)的發(fā)生。PCR檢測的539。 核酸酶測定法(TaqMan探針)： 539。核酸酶測定法被用來實時監(jiān)測反應(yīng)。這種測定法利用耐熱性DNA聚合酶的539。核酸外切酶的活性來檢測正在進行的反應(yīng)。耐熱性DNA聚合酶能夠從鏈狀DNA的539。端水解核苷酸，舊鏈在合成一條新鏈時被置換。裂解主要發(fā)生在置換的單鏈部分和DNA配對的雙鏈部分的連接處。這導(dǎo)致單核苷酸和寡核苷酸從置換的DNA鏈的539。末端被釋放。DNA聚合酶的這種特性被用來監(jiān)測反應(yīng)。在539。端核酸酶檢測法中FRET DNA雙重探針是短的寡核苷酸，與擴增DNA靶序列和修飾的339。端互補，以至于他們不能在339。端延長。他們在339。和539。末端用熒光基團標記。報告熒光染料被放置在539。末端，粹滅劑被放置在探針的339。末端。在完整的探針中，染料的熒光性被消除，在PCR反應(yīng)中探針與靶序列雜交 ，借助耐熱性DNA聚合酶的539。核酸酶的活性，淬滅劑與報告基因分離，從而恢復(fù)報告基因的熒光性。兩個探針被使用，一個用于正常序列，另一個用于3 bp缺失的互補序列。每個探針在539。末端有不同的報告熒光，并且一個相同的粹滅劑染料連接在從539。末端數(shù)的第七個核苷酸上。靶DNA的鑒定由熒光發(fā)射光譜決定。分子信標： 嚴格的說，熒光淬滅在使用DABCYL分子指示標中不是FRET相關(guān)的，因為它不能滿足重疊光譜的標準。然而，以FRET為基礎(chǔ)的淬滅也能被使用。分子信標被作為雜交探針后不久被應(yīng)用于PCR，利用它們能夠同互補DNA雜交的原理，它們能夠被用來監(jiān)測一個正在進行中的反應(yīng)和在實時PCR中區(qū)別等位基因。反應(yīng)完成后，反應(yīng)物加入固定有分子信標的微量滴定孔中，借助讀取產(chǎn)生的熒光檢測產(chǎn)物?；蛘哌€可用封閉試管和實時程序來檢測。在這種情況下，分子信標被直接加入到PCR混合物并且與擴增反應(yīng)中新合成的DNA雜交。與TaqMan探針相比，分子信標優(yōu)勢在于能夠進行多重PCR檢測，因為，在理論上，他們能同時測定更多的產(chǎn)品?！26. 作為反義脫氧寡核苷酸的硫磷?；押塑账?↑TOP 隨著我們對分子生物學的理解不斷加深，我們慢慢獲得對分子水平疾病的認識。合理的藥物設(shè)計變得更加可行。特別是在蛋白質(zhì)水平上分子間的反應(yīng)能夠被完美的設(shè)計，通過生物合理的途徑來提高結(jié)合性，分子間的相互作用成功的被應(yīng)用和被最佳化。合成的脫氧寡核苷酸(ODNs)已經(jīng)被Zameik和Stephenson提出作為一種新的潛在的治療方法，這種方法以一種合理的方式與信使RNA疾病關(guān)聯(lián)蛋白相互作用，并且特異的抑制它的合成。 這種被稱為反義策略的方法的優(yōu)勢在于，通過眾所周知的WatsonCrick堿基配對法則，即單鏈核酸與互補的寡核苷酸鏈相互作用形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。每個蛋白分子均遵循分子生物學的基本機制合成：一個基因(雙鏈DNA)攜帶一種特定蛋白質(zhì)的遺傳信息，被轉(zhuǎn)錄成作為信息攜帶者的單鏈mRNA，再以此作為模板在核糖體指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成(翻譯)。因此，反義策略不被限制于特定類型的疾病而能夠被廣泛地應(yīng)用。天然的寡核苷酸(DNA和RNA)不能夠達到作為反義藥物候選物的標準，不同的化學修飾將克服現(xiàn)存的障礙，它將被細胞吸收，抵抗核酸酶的降解和提高與mRNA的親和力。首先，脫氧寡核苷酸(ODNs)必須能夠穿越細胞膜到達細胞質(zhì)或細胞核。一旦進入細胞內(nèi)部，ODNs就必須抵抗核酸酶的降解。最后，為了抑制致病基因的表達，ODNs必須能夠特異性結(jié)合并對靶mRNA有高度的親和力。早期在組織培養(yǎng)中觀察到的ODNs的活性后曾認為，這些理論上的障礙不值得擔心。然而，最近文章的數(shù)據(jù)分析顯示這些理論上的障礙確實存在。 最近的研究焦點在于用化學方法改善ODNs的特性，主要集中在核苷酸酶抵抗力和mRNA親和力的提高方面。mRNA親和力對于反義策略非常重要，它常常用解鏈溫度(Tm)所反映。雙倍體核酸中，由于堿基堆積產(chǎn)生的PP相互作用, 在260 nm紫外吸收被淬滅。加熱可將其退火解鏈成單鏈，導(dǎo)致其在260 nm處的紫外的吸收增加。因此，假定一個二狀態(tài)模型，會得到一個S形曲線，并能計算其熱力學參數(shù)。這個吸收溫度曲線的中點被定義為Tm，它反映的當處于配對狀態(tài)的寡核苷酸鏈與處于單鏈狀態(tài)的寡核苷酸鏈達到平衡時的溫度。寡核苷酸的順序和長度，適用下述的法則：Tm增加3到5癈粗略的等于締合常數(shù)增加十倍。寡核苷酸的修飾主要發(fā)生在磷酸二脂的骨架。核酸酶使寡核苷酸鏈快速降解的主要原因是磷酸二脂骨架結(jié)構(gòu)的水解，部分結(jié)構(gòu)替代已成為增強穩(wěn)定性的主要策略。此外，骨架修飾能影響寡核苷酸鏈的其他性質(zhì)，如RNA親和力或細胞的吸收行為。 第一代的骨架修飾在硫磷酰中保留了磷原子。這個衍生性顯示對核酸酶具有不斷增長的抵抗力。因此，相應(yīng)的寡核苷酸用于進行體外或體內(nèi)試驗，但不幸的是，它們都顯示對靶RNA的低親和力。然而，硫磷酰被看作寡核苷酸第一代類似物，并顯示出抵抗不同靶分子的生物學活性。這種有力的行為主要歸因于生物的或化學的穩(wěn)定性，良好的藥物代謝動力學特性包括細胞的攝取以及對于這類化合物RNase H提高了裂解mRNA的能力。 硫磷酰主要是通過兩種不同的方式合成的：一種是在二氧化碳中溶解硫元素，或者借助更新的辦法，即使用Beaucage試劑( H1,2Benzodithiol1one1,1二氧化物)硫化亞磷酸三脂。后一種方法避免了硫元素在多數(shù)有機溶劑中不溶解以及二氧化碳毒性的問題。Beaucage試劑也 生產(chǎn)高純度的硫磷酰。硫磷酰合成產(chǎn)生兩種同分異構(gòu)體（R和S），即對于一個長度為n的寡核苷酸，在每一個合成位點產(chǎn)生2n1個二倍體非對映異構(gòu)體。最初，曾有關(guān)于這個同分異構(gòu)體的混合可能會產(chǎn)生不可預(yù)知的結(jié)果的擔心。然而，幸運的是，用任何標準S寡核苷酸制備同分異構(gòu)混合體不會出現(xiàn)影響生物學活性的寡核苷酸?！27. 怎樣制備雙鏈DNA? ↑TOP 把單鏈寡核苷酸制備成雙鏈DNA寡核苷酸，退火是最簡單的方法，但要求要非常小心的移去不想要的單鏈材料。在STE緩沖液(10 mM TrisHCl , 50 nM NaCl, 1 mM EDTA)中溶解高濃度(110 OD260units/100 靗)的寡核苷酸混合兩種相同的濃度單鏈寡核苷酸。加熱到94癈然后緩慢冷卻至室溫。為了避免形成復(fù)雜的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，寡核苷酸需要更加緩慢的冷卻。雙鏈DNA終產(chǎn)品是穩(wěn)定的,建議貯存于4癈或冷凍環(huán)境?！?0 /