【正文】 或者冰，轉(zhuǎn)完后電轉(zhuǎn)液的溫度也會(huì)有一定的升高（可以用手摸一下轉(zhuǎn)移液，很容易摸出是否有溫度的升高），如果轉(zhuǎn)完后沒(méi)有溫度升高（和初始的轉(zhuǎn)移液溫度相同），說(shuō)明根本就沒(méi)有有效的轉(zhuǎn)移。可能是轉(zhuǎn)移槽的蓋子沒(méi)蓋緊，電源沒(méi)接上，轉(zhuǎn)移槽支架上的金屬絲斷了，或者某個(gè)地方的電線接觸不好。請(qǐng)注意這一點(diǎn)，感覺(jué)轉(zhuǎn)移完成后，轉(zhuǎn)移液的溫度并沒(méi)有升高的可能性比較大，如果這樣，轉(zhuǎn)不過(guò)去的原因就如上述。感覺(jué)問(wèn)題在此點(diǎn)的可能性比較大?！?】電轉(zhuǎn)液（轉(zhuǎn)移液）是怎么配制的？我用的是如下配方，盡管配方并不都是相同的，但應(yīng)該還是差不多的，看一下，是不是電轉(zhuǎn)液有問(wèn)題。轉(zhuǎn)移緩沖液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，％ SDS，20％甲醇）甘氨酸（） Tris（） SDS 甲醇 200ml蒸餾水至 1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用3～5次。上面是1的，配制時(shí)可以配成10的，然后應(yīng)用時(shí)再稀釋成1的?！?】轉(zhuǎn)膜一般還是用衡流好一些，所以最好不要用衡壓，而用衡流?！?】即使膠和膜的位置放反了，或者夾膜的夾子黑面和白面放反了，膠上的蛋白也會(huì)轉(zhuǎn)走的，轉(zhuǎn)不到膜上，也會(huì)轉(zhuǎn)到其他地方的，而不會(huì)在膠上的?！?8】做WB幾個(gè)月了，一直不成功，很郁悶，請(qǐng)各位戰(zhàn)友幫忙分析一下問(wèn)題出在哪了，先在這里謝過(guò)?。∥易龅哪康牡鞍子袃蓚€(gè)，分子量分別為28KD和57KD，內(nèi)參是action，分子量42KD，使用藍(lán)色預(yù)染蛋白Marker，跑膠結(jié)束后可以看到Marker條帶，基本與說(shuō)明書(shū)上的圖示吻合，用考藍(lán)G250染色，可以看到Marker以及蛋白樣本的條帶。重新跑膠后轉(zhuǎn)膜，2小時(shí)，可以看到PVDF膜上的Marker條帶，不是很清晰（個(gè)人考慮與上樣量有關(guān)，5微升），麗春紅染色未見(jiàn)條帶，封閉2小時(shí)，一抗（1：500）孵育，室溫2小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，洗膜3次，每次10分鐘，同法二抗（1：1000）孵育、洗膜后顯影。壓片5分鐘到30分鐘都用過(guò)，暗室中看不到條帶熒光，顯影、定影后也是白板一塊，沒(méi)有一點(diǎn)痕跡。（用孵育后的二抗稀釋液和發(fā)光液直接反應(yīng)可以看到熒光，覺(jué)得可以排除發(fā)光液和二抗的問(wèn)題。）請(qǐng)各位戰(zhàn)友幫我分析一下問(wèn)題在哪兒，感激不盡?。?！答：【1】ECL的靈敏度遠(yuǎn)大于麗春紅，所以麗春紅染色染不出，曝光的時(shí)候同樣可能曝出來(lái)的。大家說(shuō)麗春紅的敏感性比較低，所以現(xiàn)在已經(jīng)不做麗春紅了，但是曝光還是一片白板，說(shuō)明前面肯定有比較關(guān)鍵的錯(cuò)誤答：一般做的比較熟練的，或者做的比較成功的這一步可以不做的。象這么長(zhǎng)時(shí)間結(jié)果還沒(méi)出來(lái)，這一步最好做一下。你可以上樣時(shí)多加幾個(gè)孔，轉(zhuǎn)膜完成后把這幾個(gè)孔用剪刀剪下來(lái)，去麗春紅染色。其他的繼續(xù)做?！?】轉(zhuǎn)膜是挺重要的一步，膜先要用甲醇泡，然后用轉(zhuǎn)移液泡?？梢韵葴y(cè)量一下蛋白濃度，看蛋白濃度是不是合適。我用的PVDF膜，每次用100%甲醇浸泡1015分鐘，然后轉(zhuǎn)膜液浸泡1020分鐘，是否達(dá)到要求？蛋白濃度12微克/微升，上樣量25微升（，只能上這么多了），上樣量是否夠？答：甲醇一般不用泡那么長(zhǎng)時(shí)間的。一般來(lái)說(shuō)是15秒－20分鐘的時(shí)間，只要泡透就行了，在甲醇里，膜一般是很容易透的。我都是泡1－2分鐘。然后放入轉(zhuǎn)移液，我在轉(zhuǎn)移液中放的時(shí)間是比較長(zhǎng)的，一般泡1－2小時(shí)，就是早早的就把濾紙，海綿，膜等物質(zhì)放入里面。上樣量一般來(lái)說(shuō)20－30微克就可以了。如果目的蛋白低表達(dá)的話，可以把上樣量加到100微克。你的是什么蛋白？組織還是細(xì)胞？蛋白濃度怎么這么小呀？你最好還是提高一下蛋白濃度。【3】一般MARKER 要看的很清楚是比較難的。但是仔細(xì)辨認(rèn)應(yīng)該還是應(yīng)該能看到的。Marker每次都比較模糊，有時(shí)候條帶不全，不知道是轉(zhuǎn)過(guò)還是沒(méi)有轉(zhuǎn)夠？答：預(yù)染的MARKER一般來(lái)說(shuō)，所有的條帶都很清楚的轉(zhuǎn)到膜上挺難的，但是有一些條帶還是應(yīng)該比較清楚的。其他條帶仔細(xì)辨認(rèn)一般也能看的清楚的?！?9】各位前輩請(qǐng)給我指示指示，我在做western blot ,5*電泳緩沖液沒(méi)了，各位師兄師姐又不在，我就按下面比例配了，但不知道 合適不？tris , gly94g, sds5g,加去離子水至1000ml,混勻。用時(shí)取了200ml,加去離子水調(diào)至終濃度1000ml。還有個(gè)問(wèn)題，為什么電泳液使用時(shí)要配成1*的？往蛋白里加的loading buffer終濃度也要調(diào)至1*？答：【1】所謂的1就是說(shuō)是應(yīng)用時(shí)應(yīng)該應(yīng)用的濃度。所以應(yīng)用的時(shí)候，都應(yīng)該配成1的?！?】配成5或10就是為了方便，免得每次都要配的麻煩。【3】下面是1電泳液的配制方法，你的是5*的。正好是5倍的關(guān)系，你的配方是正確的。電泳液緩沖液（25mmol/L Tris，％ SDS）Tris（） 甘氨酸（） SDS 1g蒸餾水至 1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用3～5次?！?0】版上精華區(qū)、歸檔區(qū)的帖子我也都看過(guò)了。對(duì)于western顯色熒光淬滅的解釋都是蛋白濃度、一抗或者二抗?jié)舛冗^(guò)高的緣故。我也曾試過(guò)我二抗?jié)舛冉档酵扑]的最低，可是還是不行。下面我把我的具體情況給大家說(shuō)一下，希望同仁們多多幫助，不吝賜教！我是提取細(xì)胞裂解液上樣，最初的時(shí)候因?yàn)橐獧z測(cè)的蛋白表達(dá)量低所以上樣60ug，用的的PIERCE的熒光顯色，開(kāi)始1：2000稀釋二抗，顯色結(jié)果很好，熒光也非常亮，非常持久，stripping 3次以后還是能得到持久的熒光顯色。但是不知道從什么時(shí)候開(kāi)始，莫明的就出現(xiàn)了熒光很快淬滅的現(xiàn)象。就是加上顯色底物以后，熒光就遲也在2分鐘內(nèi)消失。我在版上和PIERCE的說(shuō)明書(shū)上仔細(xì)的學(xué)習(xí)過(guò)了，都是說(shuō)二抗的濃度高，后來(lái)我就把二抗降到說(shuō)明書(shū)推薦的1：5000,在暗室中觀察加上顯色底物熒光非常暗，但還是會(huì)很快消失。后來(lái)我又把上樣時(shí)的蛋白總量減半但還是不能解決問(wèn)題。我的問(wèn)題有這么幾個(gè)：1. 以前1：2000的二抗?jié)舛?，熒光有量又持久，而現(xiàn)在二抗降的再低都不行，這是為什么呢？2. 熒光消失以后再補(bǔ)加顯色底物，熒光亮一下，消失的更快，而且把底片在膜上一壓，熒光就馬上淬滅，這又是為什么呢？3. 我還發(fā)現(xiàn)如果一張膜雜一個(gè)抗體時(shí)淬滅，stripping后雜別的抗體都會(huì)淬滅現(xiàn)在都快瘋了，和以前做實(shí)驗(yàn)的步驟方法都沒(méi)有差別，但現(xiàn)在一曝光就淬滅，懇求大家?guī)蛶兔Π。?！答：很多情況都會(huì)導(dǎo)致熒光淬滅，可能每個(gè)人的情況并不相同。【1】用保鮮膜包好的帶熒光的膜，千萬(wàn)不要放到金屬表面，碰到金屬表面，熒光會(huì)迅速的淬滅。因?yàn)橛行┳雷邮墙饘俚?，所以放到上面?huì)導(dǎo)致熒光迅速淬滅。這是親身經(jīng)歷的。有些戰(zhàn)友提到用鑷子碰到膜會(huì)導(dǎo)致熒光淬滅，可能是因?yàn)殍囎邮墙饘俚木壒?。?】不注意的時(shí)候，把ECL的A和B混合了，以后再用，也會(huì)導(dǎo)致熒光淬滅。各溶液使用后，請(qǐng)蓋緊瓶蓋，以防失效。特別是B液，含有氧化劑，比較容易被還原而失效?！?】熒光可能對(duì)一些物質(zhì)敏感，導(dǎo)致熒光淬滅。所以，盡量使和熒光接觸的物品都是干凈的。我以前都是用保鮮包裹膜，然后曝光，但是保鮮膜太薄，容易卷起來(lái)，我就用較厚的塑料袋，但是發(fā)現(xiàn)熒光一接觸塑料袋就迅速淬滅，我估計(jì)可能是因?yàn)楹笏芰洗喜桓蓛?，有些?dǎo)致淬滅的物質(zhì)。后來(lái)繼續(xù)應(yīng)用保鮮膜，就沒(méi)有出現(xiàn)類(lèi)似情況了?！?】熒光淬滅和蛋白抗體等也有原因。我以前就碰到過(guò)，我的是5個(gè)條帶，發(fā)生淬滅的時(shí)候，有快有慢，不是5個(gè)條帶一起淬滅。盡管后來(lái)都淬滅了。所以，估計(jì)和蛋白抗體等也有關(guān)系，但可能并不是主要的原因?！?1】我因?yàn)樽鰓estern blot 總是沒(méi)結(jié)果，就嚴(yán)格按照cell signa的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將多抗用5%的BSA稀釋成10ml后4度冰箱孵育過(guò)夜，但是依然無(wú)結(jié)果。我將稀釋后的 抗體準(zhǔn)備重復(fù)使用，但是原來(lái)未稀釋前在20度時(shí)抗體不結(jié)冰，現(xiàn)在稀釋后則結(jié)冰，這樣用時(shí)反復(fù)凍融會(huì)不會(huì)影響結(jié)果。還是抗體在稀釋后應(yīng)放4度保存？另外我想問(wèn)一下這樣的抗體一般可用幾次。如果是在室溫下孵育的抗體可不可以重復(fù)用，上次我用此抗體，連原來(lái)做出來(lái)的都未出結(jié)果。答：【1】的確有的一抗可以反復(fù)應(yīng)用很多次的，有的用幾次就不好用了。主要跟抗體的特性、質(zhì)量等有關(guān)，跟儲(chǔ)存等情況也有關(guān)。所以，一種一抗稀釋液用多長(zhǎng)時(shí)間，一般只有用了才知道。【2】當(dāng)然用一次也可以的，我就是用一次。每次的用量是400微升～1毫升。效果也是很好的。我就是用塑料袋做成小袋子，然后把膜放到里面，然后把一抗稀釋液放到里面。然后用封膜機(jī)把口封上。這樣一抗稀釋液就可以把膜全包上了。【3】二抗也可以這樣用，也是很省的，不用重復(fù)應(yīng)用的。【42】求助各位戰(zhàn)友，轉(zhuǎn)膜完用麗舂紅染色有條帶，但是一抗二抗孵育后ECL顯影照相沒(méi)條帶，急答：【1】目的條帶沒(méi)出來(lái)，首先確定樣品里有沒(méi)有這種蛋白，含量如何？【2】可以加大上樣量，或/并提高蛋白濃度。【3】蛋白不要放太長(zhǎng)的時(shí)間，防止蛋白降解。（提取蛋白時(shí)，裂解蛋白時(shí)不要忘了放蛋白酶抑制劑）【4】加大一抗的濃度，就是降低稀釋比例?！?】增加一抗的孵育時(shí)間。【6】（曝光后白板一張，不存在背景過(guò)強(qiáng)的問(wèn)題），可以增加二抗的濃度，增加二抗的孵育時(shí)間?！?】可以增加膜放在ECL中的時(shí)間。增加曝光時(shí)間?！?】另外注意二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光的可能。前面的方法都用了，還不行的話，就要注意這一點(diǎn)了。可以降低二抗?jié)舛?，或者更換二抗【43】最近打算做ECL發(fā)光(以前用DAB顯色),但是沒(méi)見(jiàn)過(guò)師兄師姐用過(guò),關(guān)于顯影定影問(wèn)題,有很多都不懂,望各位老師幫幫忙.,是不是避光后(鋁箔紙包住瓶子)放4度冰箱,還是室溫就可以?(現(xiàn)在天氣開(kāi)始轉(zhuǎn)熱了,不知道室溫是否可以),?(我買(mǎi)的是粉劑,直接加水就可以用).是不是只要顯影液定影液能浸泡過(guò)膠片就可以??我打算用普通的玻璃瓶裝,外面包一層鋁箔紙,可以嗎??我買(mǎi)了顯影定影粉各一包(各可以配成一升溶液),不知道夠不夠用?如果是兩個(gè)月內(nèi)天天做,大概要用多少?過(guò)幾天就要開(kāi)始做顯影定影了,麻煩各位老師幫幫忙,非常感謝答：,是不是避光后(鋁箔紙包住瓶子)放4度冰箱,還是室溫就可以?(現(xiàn)在天氣開(kāi)始轉(zhuǎn)熱了,不知道室溫是否可以)【1】放室溫可以的，當(dāng)然，放在4度冰箱就更好了。用鋁箔紙包住當(dāng)然可以，其實(shí)用那種有顏色（棕色）的玻璃瓶裝也可以的。,?(我買(mǎi)的是粉劑,直接加水就可以用).是不是只要顯影液定影液能浸泡過(guò)膠片就可以?【2】你說(shuō)的很對(duì)，就是能把膠片淹沒(méi)就好了，所以要看你膠片的大小和盛放膠片的容器的大小。我顯影和定影液各自配了500毫升。顯影液和定影液用久了，曝光的效果就不好了，逐漸混濁，有雜質(zhì)。所以，最好用一個(gè)月就換一下。?我打算用普通的玻璃瓶裝,外面包一層鋁箔紙,可以嗎?【3】沒(méi)有特殊要求，你說(shuō)的完全可以。當(dāng)然，前面已經(jīng)說(shuō)了?？梢杂脦旧牟Ａ浚ㄆ鸨芄獾淖饔茫┭b。?我買(mǎi)了顯影定影粉各一包(各可以配成一升溶液),不知道夠不夠用?如果是兩個(gè)月內(nèi)天天做,大概要用多少?【4】哈，這要看你膠片的大小和盛放膠片的盒子的大小。如果放500毫升液體就能把膠片淹沒(méi)的話，如果兩個(gè)月做完的話，正好夠用。【44】各位大蝦，其有復(fù)合物25KDa（二硫鍵結(jié)合）。復(fù)合物本人使用非還原loding buffer已經(jīng)做出了，證明抗體應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題。，我使用tricine系統(tǒng)，還原的loding buffer，且加熱了。用濃縮膠4％，分離膠10％＋16％的方法，轉(zhuǎn)膜為濕轉(zhuǎn)，30V，60min，70min，80min都試過(guò)，預(yù)染Marker最小為10KDa，膜上出現(xiàn)了，膠上還剩下一點(diǎn)。但是敷育抗體后沒(méi)有做出。儀器為Bio Rad cm的mini膠。請(qǐng)各位指導(dǎo)一下到底是什么，不勝感激！答：分子量有些小，不太容易出結(jié)果。最好每一步都做的更加仔細(xì)、更加到位。【1】分子量小，電泳的時(shí)候不要時(shí)間太長(zhǎng)。下面的蘭色跑到膠的1/3左右一般就可以了。跑的久了，小分子量的蛋白很容易跑散了?！?】如果沒(méi)有把握，可以一步一步來(lái)。先用考馬斯蘭染一下膠，證明膠上有。然后可以用麗春紅染色（這步熟了以后最好不要做，因?yàn)檫@會(huì)對(duì)以后的結(jié)果有影響。）?！?】轉(zhuǎn)膜還是以電流算好一些吧。一般都是衡流吧。最好電流小一些?！?】看你寫(xiě)的，可以看到10KD的Marker,但是膜上和膠上都有，說(shuō)明還是不放心。正常應(yīng)該全部轉(zhuǎn)到膜上才好，估計(jì)你也是擔(dān)心小分子的轉(zhuǎn)過(guò)頭了。所以，你現(xiàn)在首先要確定目的蛋白轉(zhuǎn)到膜上了。其實(shí)，不用麗春紅染色，用眼直接看，比用麗春紅染色的還要清楚。方法是，但轉(zhuǎn)膜完成后，把膜拿出來(lái)，在膜逐漸干燥的過(guò)程中，膜會(huì)逐漸變成白染色。當(dāng)膜剛變成白染色的時(shí)候，上面就會(huì)出現(xiàn)一些濕的、未干的條帶，這些條帶就是蛋白條帶。當(dāng)然，再過(guò)一會(huì)，這些條帶也會(huì)變白的，所以，要一直看著。【5】綜合一下，最好一步一步來(lái)，每一步的條件摸準(zhǔn)。先保證膠上有，然后濕保證膜上有，然后再曝光。這樣就可以做到結(jié)果沒(méi)出來(lái)的時(shí)候，心中有數(shù)，到底是哪里出了問(wèn)題?！?5】92kd的蛋白應(yīng)選什么濃度的分離膠和濃縮膠啊答：【1】分離膠的濃度和最佳分離范圍：（1）SDSPAGE分離膠濃度 －－－ 最佳分離范圍 （KD)6%膠 －－－－ －－－－－－－－50150 8%膠 －－－－ －－－－－－－－3090 10%膠 －－－－－－－－－－－－2080 12%膠 －－－－－－－－－－－－10－40 （2）分離膠濃度（％） －－－ 線性分離范圍（KD)15 －－－－－ －－－－－－ －－124310 －－－－ －－－－－－－－－1668 －－－－－－－－－－－－3694 －－－－ －－－－－－－ －57212【2】濃縮膠一般都是選4％或者5％下面是5％膠的配制方法：成分 配制不同體積SDSPAGE濃縮膠所需各成分的體積(毫升) 5%膠 － － 2 － － 3 － － 4 － － 6 － － 8 － － 10 蒸餾水 － －