【正文】 或者冰，轉完后電轉液的溫度也會有一定的升高（可以用手摸一下轉移液，很容易摸出是否有溫度的升高），如果轉完后沒有溫度升高（和初始的轉移液溫度相同），說明根本就沒有有效的轉移?？赡苁寝D移槽的蓋子沒蓋緊，電源沒接上，轉移槽支架上的金屬絲斷了，或者某個地方的電線接觸不好。請注意這一點，感覺轉移完成后，轉移液的溫度并沒有升高的可能性比較大，如果這樣，轉不過去的原因就如上述。感覺問題在此點的可能性比較大?！?】電轉液（轉移液）是怎么配制的？我用的是如下配方，盡管配方并不都是相同的，但應該還是差不多的，看一下，是不是電轉液有問題。轉移緩沖液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，％ SDS，20％甲醇）甘氨酸（） Tris（） SDS 甲醇 200ml蒸餾水至 1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復使用3～5次。上面是1的，配制時可以配成10的，然后應用時再稀釋成1的?！?】轉膜一般還是用衡流好一些，所以最好不要用衡壓，而用衡流。【4】即使膠和膜的位置放反了，或者夾膜的夾子黑面和白面放反了，膠上的蛋白也會轉走的，轉不到膜上，也會轉到其他地方的，而不會在膠上的?！?8】做WB幾個月了，一直不成功，很郁悶，請各位戰(zhàn)友幫忙分析一下問題出在哪了，先在這里謝過！！我做的目的蛋白有兩個，分子量分別為28KD和57KD，內(nèi)參是action，分子量42KD，使用藍色預染蛋白Marker，跑膠結束后可以看到Marker條帶，基本與說明書上的圖示吻合，用考藍G250染色，可以看到Marker以及蛋白樣本的條帶。重新跑膠后轉膜，2小時，可以看到PVDF膜上的Marker條帶，不是很清晰（個人考慮與上樣量有關，5微升），麗春紅染色未見條帶，封閉2小時，一抗（1：500）孵育，室溫2小時或更長時間，洗膜3次，每次10分鐘，同法二抗（1：1000）孵育、洗膜后顯影。壓片5分鐘到30分鐘都用過，暗室中看不到條帶熒光，顯影、定影后也是白板一塊，沒有一點痕跡。（用孵育后的二抗稀釋液和發(fā)光液直接反應可以看到熒光，覺得可以排除發(fā)光液和二抗的問題。）請各位戰(zhàn)友幫我分析一下問題在哪兒，感激不盡?。。〈穑骸?】ECL的靈敏度遠大于麗春紅，所以麗春紅染色染不出，曝光的時候同樣可能曝出來的。大家說麗春紅的敏感性比較低，所以現(xiàn)在已經(jīng)不做麗春紅了，但是曝光還是一片白板，說明前面肯定有比較關鍵的錯誤答：一般做的比較熟練的，或者做的比較成功的這一步可以不做的。象這么長時間結果還沒出來，這一步最好做一下。你可以上樣時多加幾個孔，轉膜完成后把這幾個孔用剪刀剪下來，去麗春紅染色。其他的繼續(xù)做?！?】轉膜是挺重要的一步，膜先要用甲醇泡，然后用轉移液泡。可以先測量一下蛋白濃度，看蛋白濃度是不是合適。我用的PVDF膜，每次用100%甲醇浸泡1015分鐘，然后轉膜液浸泡1020分鐘，是否達到要求？蛋白濃度12微克/微升，上樣量25微升（，只能上這么多了），上樣量是否夠？答：甲醇一般不用泡那么長時間的。一般來說是15秒－20分鐘的時間，只要泡透就行了，在甲醇里，膜一般是很容易透的。我都是泡1－2分鐘。然后放入轉移液，我在轉移液中放的時間是比較長的，一般泡1－2小時，就是早早的就把濾紙，海綿，膜等物質(zhì)放入里面。上樣量一般來說20－30微克就可以了。如果目的蛋白低表達的話，可以把上樣量加到100微克。你的是什么蛋白？組織還是細胞？蛋白濃度怎么這么小呀？你最好還是提高一下蛋白濃度?！?】一般MARKER 要看的很清楚是比較難的。但是仔細辨認應該還是應該能看到的。Marker每次都比較模糊，有時候條帶不全，不知道是轉過還是沒有轉夠？答：預染的MARKER一般來說，所有的條帶都很清楚的轉到膜上挺難的，但是有一些條帶還是應該比較清楚的。其他條帶仔細辨認一般也能看的清楚的?！?9】各位前輩請給我指示指示，我在做western blot ,5*電泳緩沖液沒了，各位師兄師姐又不在，我就按下面比例配了，但不知道 合適不？tris , gly94g, sds5g,加去離子水至1000ml,混勻。用時取了200ml,加去離子水調(diào)至終濃度1000ml。還有個問題，為什么電泳液使用時要配成1*的？往蛋白里加的loading buffer終濃度也要調(diào)至1*？答：【1】所謂的1就是說是應用時應該應用的濃度。所以應用的時候，都應該配成1的?！?】配成5或10就是為了方便，免得每次都要配的麻煩。【3】下面是1電泳液的配制方法，你的是5*的。正好是5倍的關系，你的配方是正確的。電泳液緩沖液（25mmol/L Tris，％ SDS）Tris（） 甘氨酸（） SDS 1g蒸餾水至 1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復使用3～5次?！?0】版上精華區(qū)、歸檔區(qū)的帖子我也都看過了。對于western顯色熒光淬滅的解釋都是蛋白濃度、一抗或者二抗?jié)舛冗^高的緣故。我也曾試過我二抗?jié)舛冉档酵扑]的最低，可是還是不行。下面我把我的具體情況給大家說一下，希望同仁們多多幫助，不吝賜教！我是提取細胞裂解液上樣，最初的時候因為要檢測的蛋白表達量低所以上樣60ug，用的的PIERCE的熒光顯色，開始1：2000稀釋二抗，顯色結果很好，熒光也非常亮，非常持久，stripping 3次以后還是能得到持久的熒光顯色。但是不知道從什么時候開始，莫明的就出現(xiàn)了熒光很快淬滅的現(xiàn)象。就是加上顯色底物以后，熒光就遲也在2分鐘內(nèi)消失。我在版上和PIERCE的說明書上仔細的學習過了，都是說二抗的濃度高，后來我就把二抗降到說明書推薦的1：5000,在暗室中觀察加上顯色底物熒光非常暗，但還是會很快消失。后來我又把上樣時的蛋白總量減半但還是不能解決問題。我的問題有這么幾個：1. 以前1：2000的二抗?jié)舛?，熒光有量又持久，而現(xiàn)在二抗降的再低都不行，這是為什么呢？2. 熒光消失以后再補加顯色底物，熒光亮一下，消失的更快，而且把底片在膜上一壓，熒光就馬上淬滅，這又是為什么呢？3. 我還發(fā)現(xiàn)如果一張膜雜一個抗體時淬滅，stripping后雜別的抗體都會淬滅現(xiàn)在都快瘋了，和以前做實驗的步驟方法都沒有差別，但現(xiàn)在一曝光就淬滅，懇求大家?guī)蛶兔Π。?！答：很多情況都會導致熒光淬滅，可能每個人的情況并不相同。【1】用保鮮膜包好的帶熒光的膜，千萬不要放到金屬表面，碰到金屬表面，熒光會迅速的淬滅。因為有些桌子是金屬的，所以放到上面會導致熒光迅速淬滅。這是親身經(jīng)歷的。有些戰(zhàn)友提到用鑷子碰到膜會導致熒光淬滅，可能是因為鑷子是金屬的緣故?！?】不注意的時候，把ECL的A和B混合了，以后再用，也會導致熒光淬滅。各溶液使用后，請蓋緊瓶蓋，以防失效。特別是B液，含有氧化劑，比較容易被還原而失效?！?】熒光可能對一些物質(zhì)敏感，導致熒光淬滅。所以，盡量使和熒光接觸的物品都是干凈的。我以前都是用保鮮包裹膜，然后曝光，但是保鮮膜太薄，容易卷起來，我就用較厚的塑料袋，但是發(fā)現(xiàn)熒光一接觸塑料袋就迅速淬滅，我估計可能是因為后塑料袋上不干凈，有些導致淬滅的物質(zhì)。后來繼續(xù)應用保鮮膜，就沒有出現(xiàn)類似情況了?！?】熒光淬滅和蛋白抗體等也有原因。我以前就碰到過，我的是5個條帶，發(fā)生淬滅的時候，有快有慢，不是5個條帶一起淬滅。盡管后來都淬滅了。所以，估計和蛋白抗體等也有關系，但可能并不是主要的原因?！?1】我因為做western blot 總是沒結果，就嚴格按照cell signa的說明書進行操作，將多抗用5%的BSA稀釋成10ml后4度冰箱孵育過夜，但是依然無結果。我將稀釋后的 抗體準備重復使用，但是原來未稀釋前在20度時抗體不結冰，現(xiàn)在稀釋后則結冰，這樣用時反復凍融會不會影響結果。還是抗體在稀釋后應放4度保存？另外我想問一下這樣的抗體一般可用幾次。如果是在室溫下孵育的抗體可不可以重復用，上次我用此抗體，連原來做出來的都未出結果。答：【1】的確有的一抗可以反復應用很多次的，有的用幾次就不好用了。主要跟抗體的特性、質(zhì)量等有關，跟儲存等情況也有關。所以，一種一抗稀釋液用多長時間，一般只有用了才知道?！?】當然用一次也可以的，我就是用一次。每次的用量是400微升～1毫升。效果也是很好的。我就是用塑料袋做成小袋子，然后把膜放到里面，然后把一抗稀釋液放到里面。然后用封膜機把口封上。這樣一抗稀釋液就可以把膜全包上了?！?】二抗也可以這樣用，也是很省的，不用重復應用的?！?2】求助各位戰(zhàn)友，轉膜完用麗舂紅染色有條帶，但是一抗二抗孵育后ECL顯影照相沒條帶，急答：【1】目的條帶沒出來，首先確定樣品里有沒有這種蛋白，含量如何？【2】可以加大上樣量，或/并提高蛋白濃度?！?】蛋白不要放太長的時間，防止蛋白降解。（提取蛋白時，裂解蛋白時不要忘了放蛋白酶抑制劑）【4】加大一抗的濃度，就是降低稀釋比例?！?】增加一抗的孵育時間?！?】（曝光后白板一張，不存在背景過強的問題），可以增加二抗的濃度，增加二抗的孵育時間。【7】可以增加膜放在ECL中的時間。增加曝光時間。【8】另外注意二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光的可能。前面的方法都用了，還不行的話，就要注意這一點了?？梢越档投?jié)舛?，或者更換二抗【43】最近打算做ECL發(fā)光(以前用DAB顯色),但是沒見過師兄師姐用過,關于顯影定影問題,有很多都不懂,望各位老師幫幫忙.,是不是避光后(鋁箔紙包住瓶子)放4度冰箱,還是室溫就可以?(現(xiàn)在天氣開始轉熱了,不知道室溫是否可以),?(我買的是粉劑,直接加水就可以用).是不是只要顯影液定影液能浸泡過膠片就可以??我打算用普通的玻璃瓶裝,外面包一層鋁箔紙,可以嗎??我買了顯影定影粉各一包(各可以配成一升溶液),不知道夠不夠用?如果是兩個月內(nèi)天天做,大概要用多少?過幾天就要開始做顯影定影了,麻煩各位老師幫幫忙,非常感謝答：,是不是避光后(鋁箔紙包住瓶子)放4度冰箱,還是室溫就可以?(現(xiàn)在天氣開始轉熱了,不知道室溫是否可以)【1】放室溫可以的，當然，放在4度冰箱就更好了。用鋁箔紙包住當然可以，其實用那種有顏色（棕色）的玻璃瓶裝也可以的。,?(我買的是粉劑,直接加水就可以用).是不是只要顯影液定影液能浸泡過膠片就可以?【2】你說的很對，就是能把膠片淹沒就好了，所以要看你膠片的大小和盛放膠片的容器的大小。我顯影和定影液各自配了500毫升。顯影液和定影液用久了，曝光的效果就不好了，逐漸混濁，有雜質(zhì)。所以，最好用一個月就換一下。?我打算用普通的玻璃瓶裝,外面包一層鋁箔紙,可以嗎?【3】沒有特殊要求，你說的完全可以。當然，前面已經(jīng)說了?？梢杂脦旧牟Ａ浚ㄆ鸨芄獾淖饔茫┭b。?我買了顯影定影粉各一包(各可以配成一升溶液),不知道夠不夠用?如果是兩個月內(nèi)天天做,大概要用多少?【4】哈，這要看你膠片的大小和盛放膠片的盒子的大小。如果放500毫升液體就能把膠片淹沒的話，如果兩個月做完的話，正好夠用?！?4】各位大蝦，其有復合物25KDa（二硫鍵結合）。復合物本人使用非還原loding buffer已經(jīng)做出了，證明抗體應該沒有問題。，我使用tricine系統(tǒng)，還原的loding buffer，且加熱了。用濃縮膠4％，分離膠10％＋16％的方法，轉膜為濕轉，30V，60min，70min，80min都試過，預染Marker最小為10KDa，膜上出現(xiàn)了，膠上還剩下一點。但是敷育抗體后沒有做出。儀器為Bio Rad cm的mini膠。請各位指導一下到底是什么，不勝感激！答：分子量有些小，不太容易出結果。最好每一步都做的更加仔細、更加到位。【1】分子量小，電泳的時候不要時間太長。下面的蘭色跑到膠的1/3左右一般就可以了。跑的久了，小分子量的蛋白很容易跑散了?！?】如果沒有把握，可以一步一步來。先用考馬斯蘭染一下膠，證明膠上有。然后可以用麗春紅染色（這步熟了以后最好不要做，因為這會對以后的結果有影響。）?！?】轉膜還是以電流算好一些吧。一般都是衡流吧。最好電流小一些?！?】看你寫的，可以看到10KD的Marker,但是膜上和膠上都有，說明還是不放心。正常應該全部轉到膜上才好，估計你也是擔心小分子的轉過頭了。所以，你現(xiàn)在首先要確定目的蛋白轉到膜上了。其實，不用麗春紅染色，用眼直接看，比用麗春紅染色的還要清楚。方法是，但轉膜完成后，把膜拿出來，在膜逐漸干燥的過程中，膜會逐漸變成白染色。當膜剛變成白染色的時候，上面就會出現(xiàn)一些濕的、未干的條帶，這些條帶就是蛋白條帶。當然，再過一會，這些條帶也會變白的，所以，要一直看著?！?】綜合一下，最好一步一步來，每一步的條件摸準。先保證膠上有，然后濕保證膜上有，然后再曝光。這樣就可以做到結果沒出來的時候，心中有數(shù)，到底是哪里出了問題?！?5】92kd的蛋白應選什么濃度的分離膠和濃縮膠啊答：【1】分離膠的濃度和最佳分離范圍：（1）SDSPAGE分離膠濃度 －－－ 最佳分離范圍 （KD)6%膠 －－－－ －－－－－－－－50150 8%膠 －－－－ －－－－－－－－3090 10%膠 －－－－－－－－－－－－2080 12%膠 －－－－－－－－－－－－10－40 （2）分離膠濃度（％） －－－ 線性分離范圍（KD)15 －－－－－ －－－－－－ －－124310 －－－－ －－－－－－－－－1668 －－－－－－－－－－－－3694 －－－－ －－－－－－－ －57212【2】濃縮膠一般都是選4％或者5％下面是5％膠的配制方法：成分 配制不同體積SDSPAGE濃縮膠所需各成分的體積(毫升) 5%膠 － － 2 － － 3 － － 4 － － 6 － － 8 － － 10 蒸餾水 － －