dnarna合成常見問題解答(編輯修改稿)
2025-04-20 04:50 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 。 103 = milli [m] 103 = kilo [k] 106 = micro [m] 106 = mega [M] 109 = nano [n] 109 = giga [G] 1012 = pico [p] 1012 = tera [T] 1015 = femto [f] 1015 = peta [P] 1018 = atto [a] 1018 = exa [E] 1021 = zepto [z] 1021 = zetta [Z] 1024 = yocto [y] 1024 = yotta [Y]寡核苷酸單位換算的例子:1 pmol/181。l= 11012 mol/1106L= 1106 mol/L= 1181。mol/L= 1181。MQ15. 如何合成寡核苷酸? ↑TOP 目前最流行的用于合成寡核苷酸的方法是通過使用“亞磷酸三脂”方 法 將 單 體 連 接 ，形 成 天 然的 339。539。磷 酸 二 脂 鍵 。Koster發(fā)現(xiàn)了β氰乙基亞磷酰胺并作為構(gòu)建單體，現(xiàn)在普遍的用于寡核苷酸的合成(Nucl. Acids Res. 1984, 12,4539。 Tetrahedron Lett. 1983, 24,5843)。通過“亞磷酸三脂”的方法使用β氰乙基亞磷酰胺，合成效率能夠達(dá)到(98%)而合成時(shí)間比其它寡核苷酸的合成方法更短。而且，由于單體β氰乙基亞磷酰胺在激活以前很穩(wěn)定，這是對(duì)合成寡核苷酸來說所必需的，他們能儲(chǔ)存更長(zhǎng)的時(shí)間。當(dāng)寡核苷酸共價(jià)的連接在固相載體上就可以使其不被過量溶解β氰乙基亞磷酰胺和結(jié)合試劑的作用下，寡核苷酸被合成。在各種各樣的固相載體中，可控孔度玻片已經(jīng)在近年廣泛使用了，這種玻片是由均勻的玻璃基質(zhì)組成，上面有固定尺寸的孔。 整個(gè)寡核苷酸的合成通過一系列的反應(yīng)完成，其中包括四個(gè)循環(huán)反應(yīng)：脫保護(hù)，連接，氧化，加帽。脫保護(hù) 通過第一個(gè)循環(huán)—脫保護(hù)，CPG裂解出539。保護(hù)基團(tuán)DMT。酸性條件對(duì)于脫保護(hù)是必需的，通常使用3％三氯乙酸。據(jù)報(bào)道，寡核苷酸在酸性環(huán)境中易脫嘌呤，尤其是對(duì)于腺苷。因?yàn)槿纫宜嵊泻軓?qiáng)的酸性，所以用三氯乙酸脫保護(hù)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間不應(yīng)該太長(zhǎng)。比起三氯乙酸，二氯乙酸酸性較弱，能夠在一些情況下避免脫嘌呤問題。脫保護(hù)后產(chǎn)生的DMT陽離子呈現(xiàn)出一種深橘色。通過測(cè)定吸光度，來監(jiān)測(cè)反應(yīng)效率。連接 脫保護(hù)后，CPG上的539。羥基暴露，結(jié)合核苷β氰乙基亞磷酰胺，三亞磷酸酯氧化變成磷酸三脂，然后按順序連接。對(duì)于核苷β氰乙基亞磷酰胺，為了避免合成寡核苷酸過程中負(fù)反應(yīng)的發(fā)生，堿基的環(huán)外氨基被保護(hù)以免形成酰胺結(jié)構(gòu)。苯甲?；糜诒Ｗo(hù)酰苷和胞苷。另一方面，異丁酰基用于鳥苷堿基保護(hù)。胸苷堿基中沒有環(huán)外的胺基，所以不需要保護(hù)。β氰乙基亞磷酰胺用于保護(hù)所有核苷的539。羥基。 因?yàn)楹塑?氰乙基亞磷酰胺在正常條件下非常穩(wěn)定，不能直接和正在合成鏈上游離的539。羥基功能基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。所以，它們必須首先通過一種弱酸性激活劑激活。在各種激活劑中，四唑作為標(biāo)準(zhǔn)激活劑具有很強(qiáng)的激活作用。四唑已經(jīng)被認(rèn)為具有雙重作用：它質(zhì)子化2氰乙基亞磷酰胺的二異丙氨基，產(chǎn)生親核基團(tuán)，形成具有活性的四唑膦中間產(chǎn)物。用這種被激活的核苷亞磷酰胺試劑耦聯(lián)反應(yīng)快(不到2分鐘)，產(chǎn)量高。氧化 新合成的亞磷酸鹽和核苷酸之間的鍵合不穩(wěn)定，對(duì)酸和堿均很敏感。因此，三價(jià)的亞磷酸三脂被氧化成五價(jià)的磷酸三脂。碘是溫和的氧化劑，在堿性的四氫呋喃溶液中作為氧的供體。此步反應(yīng)非?？?，在三十秒內(nèi)就可以完成。加帽 因?yàn)榻Y(jié)合反應(yīng)在特定的時(shí)間內(nèi)不能夠定量，在每一步結(jié)合反應(yīng)中都有一小段提前終止的序列產(chǎn)生。如果這些序列進(jìn)一步參與反應(yīng)，產(chǎn)物將很難從混合序列中分離出來。通過加帽，即將自由羥基乙?；?，解決了這個(gè)問題。乙?；捎蓮?qiáng)的乙?；噭┩瓿?，該試劑是由等摩爾的醋酸酐和N甲基咪唑組成，反應(yīng)可在30秒內(nèi)完成。氧化后，核苷酸加入，循環(huán)完成。寡核苷酸合成后，移去增長(zhǎng)鏈539。末端的DMT基團(tuán)，下一個(gè)核苷酸的聚合循環(huán)開始。整個(gè)寡核苷酸合成后，借助濃氨水的處理，寡核苷酸從固相載體上分離，同時(shí)堿基和磷酸基去保護(hù)。Q16. 標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸結(jié)構(gòu) ↑TOPQ17. Bioneer能合成的最長(zhǎng)的寡核苷酸是多長(zhǎng)? ↑TOP 181。mol: 50 mer 181。mol: 50 mer 181。mol: 100 mer 181。mol: 100 mer 181。mol: 130 merQ18. 當(dāng)我預(yù)訂50nmol的寡核苷酸，產(chǎn)品卻不足50 nmol，為什么? ↑TOP 50 nmol的寡核苷酸合成不意味著能得到50 nmol的最終產(chǎn)品。50 nmol是指在寡核苷酸合成開始時(shí)固相載體負(fù)荷的數(shù)量。寡核苷酸通常是反應(yīng)所要求的量而不是最終產(chǎn)率，用戶得到的核苷酸的數(shù)量自然要比要求的少。終產(chǎn)率受寡核苷酸長(zhǎng)度、堿基組成和連接效率的影響。Q19. 能合成出高百分比“G”的寡核苷酸嗎? ↑TOP 眾所周知，含高百分比的“G”寡核苷酸不容易被合成，特別是序列中包含一行“G”。有報(bào)道，如果有四個(gè)或更多的“G”排成一行，寡核苷酸將趨向形成鳥嘌呤四聚體(Poon and MacGregor,Biopolymers, 1998, 45, 427 434)。通過次黃嘌呤核苷置換部分G，就能避免四聚體鳥苷的形成。Q20. 能提供寡核糖核酸(RNA)合成嗎？1
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