現(xiàn)代分子生物學(xué)蛋白質(zhì)-資料下載頁(yè)
2025-01-18 02:11本頁(yè)面
【正文】 活細(xì)胞生理狀態(tài)下觀察 其互作發(fā)生的時(shí)間、位置、強(qiáng)弱、所形成蛋白質(zhì)復(fù)合體的穩(wěn)定性， 以及細(xì)胞信號(hào)分子對(duì)其互作的影響等 熒光標(biāo)記技術(shù)在蛋白質(zhì)合成和降解過程研究中的應(yīng)用 蛋白質(zhì)降解：分辨 “ 陳舊的 ” 蛋白和 “ 新生的 ” 蛋白 常用方法：用不可逆標(biāo)記對(duì)某一時(shí)刻合成的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，再用另 一種顏色的熒光對(duì)遲些時(shí)候新生成的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記 例： 1）用高親和力配體或標(biāo)記有熒光基團(tuán)的抗體對(duì)內(nèi)源性蛋白和胞外蛋白 進(jìn)行標(biāo)記 2）先用一種雙砷（ biarsenical）染料標(biāo)記四半胱氨酸 （ Tetracysteine）序列，然后用另一種雙砷染料進(jìn)行標(biāo)記 FLAsH（ bisarsenical fluoroscein derivative） ： 聯(lián)砷熒光素衍生物 合成的 細(xì)胞可透 FLAsH結(jié)合四半胱氨酸 :發(fā)夾型結(jié)合物 FLAsH（綠）， ReAsH（紅）， HoXAsH（藍(lán)）， CHoXAs（藍(lán)）等 脈沖追蹤技術(shù)： Tetracysteine序列標(biāo)記的蛋白被綠色染料標(biāo)記后，形成能發(fā)出綠 色熒光的 FIAsH（綠色小點(diǎn)）；去掉綠色染料后，用紅色染料標(biāo) 記新生的蛋白，形成能發(fā)出綠色熒光的 ReAsH（紅色小點(diǎn)） HaloTag標(biāo)記 TNFdependent degradation of IkBHaloTag fusion protein. a) Time series of images showing HEK293 cells transiently expressing the IkBHaloTag fusion protein labeled with the TMR ligand. Degradation was prevented by treatment of the cells with 10 M lactacystin for 30 min. b) Mean cellular fluorescence intensities were determined at each time point c) Western blot analysis of IkBHaloTag fusion protein degradation. Cells were treated with TNF α (10 ng/mL) and harvested at the indicated times. Proteins were resolved by SDSPAGE and visualized using an antiIkB antibody. 利用依賴生色基團(tuán)的光滅活作用來控制蛋白質(zhì)的活性 通過免疫染色對(duì)目的蛋白進(jìn)行標(biāo)記，熒光基團(tuán)受光照活化后會(huì)生成 ROS， 尤其是生成單線態(tài)氧，利用這種特性將目的蛋白滅活 摧毀胞內(nèi)靶蛋白效率： ReAsH FlAsH熒光素 孔雀綠 GFP 這種滅活蛋白的方法比基因敲除或 RNA干擾好 H：電鏡下光氧化作用。對(duì) ReAsH（紅色小點(diǎn)）進(jìn)行強(qiáng)烈的光刺激后，形成 ROS ROS使 DAB發(fā)生多聚化反應(yīng)沉淀下來（棕色）， DAB沉淀可被黑色的鋨染料 著色，在電鏡下被觀察到 I： CALI作用。對(duì) ReAsH（紅色小點(diǎn)）進(jìn)行強(qiáng)烈的光刺激后生成 ROS， ROS氧化 并滅活目的蛋白 蛋白質(zhì)組學(xué)中的標(biāo)記技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記 （ Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture， SILAC） 丹麥 Mann實(shí)驗(yàn)室（ 2022），首次用于定量蛋白質(zhì)組研究 原理：分別用天然同位素 (輕型 )或穩(wěn)定同位素 (重型 )標(biāo)記的必需氨基 酸取代細(xì)胞培養(yǎng)基中相應(yīng)氨基酸，細(xì)胞經(jīng) 56個(gè)倍增周期后， 穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸完全摻入到細(xì)胞新合成的蛋白質(zhì)中替 代了原有氨基酸。不同標(biāo)記細(xì)胞的裂解蛋白按細(xì)胞數(shù)或蛋白量 等比例混合，經(jīng)分離、純化后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。 蛋白質(zhì)或蛋白復(fù)合體實(shí)時(shí)觀測(cè) Tolllike receptor Cell membrane receptor GPCR TCR MHC Interleukin receptor Draper TEPs LRP Toll樣受體 DSCAM VATPase CD分子 plement receptor GNBP CED scavenger receptors Peste Integrin Fc受體 CLSF PGRP BCR Nuclear pore plex Nimrod MAPK NF kB ARF MCR IgSF IgG IgM Eater HIV蛋白互作 蛋白互作是動(dòng)態(tài)的 Science, 2022, 320:14291430 induced fit and conformation selection mechanisms: prior to the binding interaction, the unliganded protein exists as an ensemble of conformations in dynamic equilibrium. three steps: a diffusional encounter, recognition of plementary structures contained within the conformational ensembles of the free proteins, and conformational relaxation into the final bound state Structural biology technology To realize biological macromolecule functions by threedimensional structure Xray crystallography nuclear magic resonance (NMR) spectroscopy puter graphics Cryoelectron microscopy (CryoEM)
電大資料相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1