【正文】 發(fā)酵過程參數(shù)的控制 DO值 pH 溫度 攪拌速度 發(fā) 酵 發(fā) 酵 液 冷卻接種 三角瓶培養(yǎng) 固體斜面培養(yǎng) 上罐實(shí)消 培養(yǎng)基的配制 谷氨酸發(fā)酵的工藝流程簡圖 谷氨酸發(fā)酵液 常溫等電法 等電結(jié)晶 沉降分離 脫色 中和 結(jié)晶 冷凍等電法 上清液（母液） 離子交換 谷氨酸晶體 谷氨酸晶體 冷凍結(jié)晶 濃縮結(jié)晶 谷氨酸鈉晶體（味精） 谷氨酸的分離與味精的制備 四、 谷氨酸發(fā)酵 1） 谷氨酸生產(chǎn)菌 ? 谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、黃色短桿菌。 ? 我國使用的生產(chǎn)菌株是北京棒桿菌 、北京棒桿菌 D1鈍齒棒桿菌 、棒桿菌 S914和黃色短桿菌 T613等。 谷氨酸棒桿菌 生產(chǎn)菌株特點(diǎn) 在己報(bào)道的谷氨酸生產(chǎn)菌中，除芽孢桿菌外，雖然它們在分類學(xué)上屬于不同的屬種，但都有一些 共同特點(diǎn) : 1. 革蘭氏陽性 2. 菌體為球形、短桿至棒狀 3. 不形成芽孢 4. 沒有鞭毛，不能運(yùn)動(dòng) 5. 需要生物素作為生長因子 6. 在通氣條件下才能產(chǎn)生谷氨酸。 2） 生產(chǎn)原料 發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的原料有 ? 淀粉質(zhì)原料：玉米、小麥、甘薯、大米等。其中甘薯和淀粉最為常用； ? 大米進(jìn)行浸泡磨漿，再調(diào)成 15Bx，調(diào) ，加細(xì)菌 a淀粉酶進(jìn)行液化， 85 ℃ 30min，加糖化酶 60 ℃ 糖化 24h，過濾后可供配制培養(yǎng)基。 ? 糖蜜原料：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜； ? 糖蜜原料：不宜直接用來作為谷氨酸發(fā)酵的碳源，因含豐富的生物素。 ? 預(yù)處理方法：活性碳或樹脂吸附法和亞硝酸法吸附或破壞生物素。也可以在發(fā)酵液中加入表面活性劑吐溫 60或添加中青霉素。 ? 氮源料：尿素或氨水。 3）工藝流程 味精生產(chǎn)全過程可分五個(gè)部分： 1. 原料的預(yù)處理及淀粉水解糖的制??； 2. 谷氨酸生產(chǎn)菌種子的擴(kuò)大培養(yǎng)； 3. 谷氨酸發(fā)酵； 4. 谷氨酸的提取與分離； 5. 由谷氨酸制成味精及味精成品加工 。 淀粉質(zhì)原料 → 糖化 → 中和、脫色、過濾 → 培養(yǎng)基調(diào)配→ 接種 → 發(fā)酵 → 提取 (等電點(diǎn)法、離子交換法等 ) → 谷氨酸 → 谷氨酸 Na→ 脫色 → 過濾 → 干燥 → 成品 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) ? 味精生產(chǎn)的主要原材料為淀粉 ? 輔助材料包括硫酸、液氨、碳酸鈉、 活性碳、液堿、鹽、消泡劑、淀粉酶等 ? 年產(chǎn) 12萬噸味精，主要原輔材料耗用如下表： 項(xiàng) 目 單位：噸 淀 粉 196,870 液 氨 31,108 硫 酸 35,000 碳酸鈉 30,000 活性碳 2,500 液 堿 40,000 鹽 8,000 消泡劑 77,960 淀粉酶 11,694 4） 發(fā)酵生產(chǎn)工藝 ①培養(yǎng)基成分 ? 碳源 ：碳源是構(gòu)成菌體和合成谷氨酸的碳架及能量的來源。 ? 谷氨酸產(chǎn)生菌是異養(yǎng)微生物，只能從有機(jī)物中獲得碳素，細(xì)胞進(jìn)行合成反應(yīng)所需要能量也是從氧化分解有機(jī)物過程中得到的。 ? 實(shí)際生產(chǎn)中以糖質(zhì)原料為主。培養(yǎng)基中糖濃度對谷氨酸發(fā)酵有密切的關(guān)系。在一定的范圍內(nèi)， 谷氨酸產(chǎn)量隨糖濃度的增加而增加 。 ? 氮源 ：氮源是合成菌體蛋白質(zhì)、核酸及谷氨酸的原料。碳氮比對谷氨酸發(fā)酵有很大影響。 大約 85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外 15%用于合成菌體 。 ? 谷氨酸發(fā)酵需要的氮源比一般發(fā)酵工業(yè)多得多，一般發(fā)酵工業(yè)碳氮比為 100：，谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為 100：1521。 ? 無機(jī)鹽 ：是微生物維持生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)。 ? 主要功能 ：構(gòu)成細(xì)胞的組成成分；作為酶的組成成分；激活或抑制酶的活力；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的氧化還原電位。起著調(diào)節(jié)微生物生命活動(dòng)的作用。發(fā)酵時(shí)，使用的無機(jī)離子有 K+、 Mg2+、 Fe2+、 Mn2+等陽離子和 PO4SO4 Cl－ 等陰離子，其用量如下： ? KH2PO4 %~% K2HPO4 %~% %~% %~% %~% ? 生物素 ：凡是微生物生命活動(dòng)不可缺少，而微生物自身又不能合成的微量有機(jī)物質(zhì)都稱為生長因子。 生長因子 通常是指氨基酸、嘌呤、嘧啶和 B族維生素的一種， 生物素 又叫維生素 H或輔酶 R。 ? 糖質(zhì)為碳源 的谷氨酸產(chǎn)生菌幾乎都是生物素缺陷型，這些細(xì)菌本身都不能合成生物素。生物素的作用是影響代謝途徑；影響細(xì)胞的滲透性。 ? 生長因子含量的多少，與生產(chǎn)有著十分密切的關(guān)系。實(shí)際生產(chǎn)中通過添加 玉米漿、麩皮水解液、糖蜜 等作為生長因子的來源，來滿足谷氨酸產(chǎn)生菌必須的生長因子。 ② 培養(yǎng)基 a 斜面培養(yǎng)基 ? 葡萄糖 %、牛肉膏 %、 蛋白胨 %、氯化鈉 %、瓊脂 %、 pH ~ ? 121℃ 滅菌 30min ? 32℃ 培養(yǎng) 1824h (傳代和保藏斜面不加葡萄糖 )。 b 一級(jí)種子、二級(jí)種子及發(fā)酵培養(yǎng)基 ? 一級(jí)種子 葡萄糖 %、尿素 %、KH2PO4 %、 %、玉米漿 、 pH , 1000ml裝 200250ml振蕩， 32℃ 培養(yǎng) 12h。 ? 二級(jí)種子 水解糖 %、尿素 %、玉米漿 、 K2HPO4 %、 %、 pH ,呈單個(gè)或八字排列?；罹鷶?shù)為 108109 /ml。 ? 發(fā)酵培養(yǎng)基 水解糖 1214%、尿素 %、玉米漿 、 %、 KCl %、Na2HPO4 %、 pH ③ 發(fā)酵條件的控制 a 溫度 ? 谷氨酸發(fā)酵 前期 (012h)是菌體大量繁殖階段，在此階段菌體利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)來合成核酸、蛋白質(zhì)等，供菌體繁殖用，而控制這些合成反應(yīng)的最適溫度均在 30~32℃ 。 ? 對數(shù)生長期：糖耗快，尿素大量分解使 pH上升，氨被利用 pH又迅速下降。溶氧急劇下降后維持在一定水平。菌體濃度迅速增大，菌體形態(tài)為排列整齊的八字形。不產(chǎn)酸。 12h。 ? 措施：及時(shí)供給菌體生長必須的氮源及調(diào)節(jié) pH，在 ；維持溫度 30 32℃ ? 在發(fā)酵 中、后期 ，是谷氨酸大量積累的階段，而催化谷氨酸合成的 谷氨酸脫氫酶 的最適溫度在 32~36℃ ，故發(fā)酵中、后期適當(dāng)提高罐溫對積累谷氨酸有利。 b pH值 ? 發(fā)酵液的 pH影響微生物的生長和代謝途徑。 ? 發(fā)酵前期如果 pH偏低，則菌體生長旺盛，長菌而不產(chǎn)酸；如果 pH偏高，則菌體生長緩慢，發(fā)酵時(shí)間拉長。 ? 在發(fā)酵 前期 將 pH值控制在 適，而在發(fā)酵 中、后期 將 pH值控制在 左右對提高谷氨酸產(chǎn)量有利。 c 通風(fēng) ? 在谷氨酸發(fā)酵過程中，發(fā)酵 前期 以低通風(fēng)量為宜；發(fā)酵 中、后期 以高通風(fēng)量為宜。 ? 實(shí)際生產(chǎn)上，以 氣體轉(zhuǎn)子流量計(jì) 來檢查通氣量，即以 每分鐘單位體積的通氣量表示通風(fēng)強(qiáng)度 。另外發(fā)酵罐大小不同，所需攪拌轉(zhuǎn)速與通風(fēng)量也不同。 d 泡沫的控制 ? 在發(fā)酵過程中由于強(qiáng)烈的通風(fēng)和菌體代謝產(chǎn)生的 CO2，使培養(yǎng)液 產(chǎn)生 大量的泡沫，不僅使氧在發(fā)酵液中的擴(kuò)散受阻，影響菌體的呼吸和代謝。給發(fā)酵帶來 危害 ，必須加以消泡。 ? 消泡方法 有機(jī)械消泡 (耙式、離心式、刮板式、蝶式消泡器 )和化學(xué)消泡 (天然油脂、聚酯類、醇類、硅酮等化學(xué)消泡劑 )兩種方法。 e 發(fā)酵時(shí)間 ? 不同的谷氨酸產(chǎn)生菌對糖的濃度要求也不一樣，其發(fā)酵時(shí)間也有所差異。 ? 低糖 (10%12%)發(fā)酵，其發(fā)酵時(shí)間為3638h， ? 中糖 (14%)發(fā)酵，其發(fā)酵時(shí)間為 45h。 谷氨酸發(fā)酵 例子 ? 某谷氨酸發(fā)酵，發(fā)酵過程中各種參數(shù)的變化情況如圖所示。最后的發(fā)酵液中谷氨酸的濃度很低，發(fā)酵周期較長，而這段時(shí)間卻有大量的葡萄糖被消耗，那么，這些被消耗的葡萄糖到哪里去了？ 出現(xiàn)這種情況的 原因可能 是（ 1）由于發(fā)酵過程中感染了雜菌，造成了大量的葡萄糖被消耗；（ 2） 發(fā)酵過程中發(fā)酵液的 pH值控制的不合適或者是發(fā)酵液 NH4＋濃度過高，使得產(chǎn)生的谷氨酸轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺。 ? 如以上兩種情況都不是，發(fā)酵過程中出現(xiàn)了這種異常情況，還有什么原因呢？ ? 須根據(jù)發(fā)酵過程中其他參數(shù)如溶氧濃度的變化，結(jié)合菌體形態(tài)觀察等進(jìn)一步分析，是由于發(fā)酵用培養(yǎng)基中添加的 玉米漿過量 ，導(dǎo)致生物素濃度過高，這樣菌體不能順利地實(shí)現(xiàn)從生長型到產(chǎn)物積累型的轉(zhuǎn)變，因而出現(xiàn)了這種在工業(yè)生產(chǎn)上稱之為 “ 只長菌，不產(chǎn)酸 ”的發(fā)酵異?，F(xiàn)象。 五、谷氨酸提取工藝 ①等電點(diǎn)法提取 操作簡單，收率 60％。周期長，占地面積大 ? 等電點(diǎn)法提取谷氨酸原理 ? 谷氨酸： α型斜方晶體（好）， β型鱗片狀晶體； α型結(jié)晶水分在 5～ 10%,而 β型結(jié)晶水分則高達(dá) 15～ 20%。生產(chǎn)上應(yīng)防止 β型晶體的生成。 ? 注意三個(gè)方面 1. A、發(fā)酵液純度高：谷氨酸 /殘?zhí)潜戎蹈?，膠體少，提前除菌體最好； 2. B、發(fā)酵液處理要及時(shí)； 3. C、加酸調(diào) pH、溫度、育晶時(shí)間、攪拌服從結(jié)晶規(guī)律。 20BeHCl ~ 2h 慢加酸 發(fā)酵液 第一中和點(diǎn) 停酸育晶 等電點(diǎn) ~ 低速攪拌結(jié)晶 靜止沉降 濕谷氨酸 離心分離 谷氨酸 20h 母液 等電點(diǎn)法提取谷氨酸原理 ? 谷氨酸在等電點(diǎn)時(shí) ,絕大部分以偶極離子 (GA177。 )狀態(tài)存在 ,其分子內(nèi)部正負(fù)電荷相等 ,并含有等量的帶不同電荷的陽離子 (GA+)和陰離子 (GA),因此溶液中總靜電荷等于零。由于谷氨酸分子之間相互碰撞 ,再通過靜電引力的作用 ,結(jié)合成較大的聚合體而被沉淀析出 ,因而處于 等電點(diǎn)時(shí) GA的溶解度最小 。又由于溫度對 GA的溶解度影響很大 ,溫度越低溶解度越小 ,生產(chǎn)上多采用 0～ 4℃ 。這就是工業(yè)粗提味精所用的 等電點(diǎn)法提取谷氨酸原理 等電點(diǎn)法提取谷氨酸原理 ? 等電點(diǎn) 時(shí)谷氨酸 四種離子 方式在水溶液中所占的 比例 ? GA+: %, GA177。 : %, GA: %, GA=: 105% 離子交換法提取 GA的原理 ? 離子交換法提取 GA的原理當(dāng)氨基酸 pH值大于 時(shí)羧基離解而帶負(fù)電 ,它能被 陰離子交換 樹脂吸附 。當(dāng) pH小于 ,此時(shí)能被陽離子交換樹脂 吸附。 ? 離子交換法提取 GA是利用陽離子交換樹脂對 GA陽離子的選擇性吸附 ,以使發(fā)酵液中阻礙 GA結(jié)晶的殘?zhí)羌疤堑木酆衔?、蛋白質(zhì)、色素等非離子性雜質(zhì)得以分離 ,然后經(jīng)洗脫達(dá)到濃縮提取 GA的目的。 ② 離子交換法提取 ② 離子交換法提取 ? 發(fā)酵液 → 稀釋并 調(diào) ?→ 上柱 → 732陽離子 (H型 )交換 → 70℃ 水洗 *（正或反洗） → 60℃4%NaOH 液正洗脫 → 高流分收集 → 調(diào) → 結(jié)晶 → 離心分離 → 谷氨酸 ? 樹脂 ：苯乙烯型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂 73 730和甲基丙烯酸弱酸型陽離子交換樹脂。 ? 樹脂處理 ：柱 → 水洗（正和反洗） → % HCl再生 → 水洗 ? 水洗 *:洗脫粘附于樹脂表面的菌體、膠體 ,并疏松樹脂 ? 料液中不僅有 GA，還有 NH4+和其他金屬離子 。陽離子交換樹脂對 NH4+和其他金屬離子的親和力大于對谷氨酸的親和力 。上柱時(shí) NH4+和其他金屬離子先發(fā)生交換，把 H+置換下來，液體pH降低，使主要以 GA+形式存在，隨后 GA+發(fā)生交換。 ? 水洗 *目的 : 1. 溫柱，防止 GA在柱中結(jié)晶析出產(chǎn)生 “ 結(jié)柱 ” 2. 預(yù)熱樹脂，避免熱堿液聚熱發(fā)生破碎 ? 采用 NaOH洗脫劑洗脫時(shí) ,由于谷氨酸在樹脂內(nèi)部較為集中 ,NaOH濃度不能太高 ,溫度又不能太低。一般以 4%的濃度 ,60～ 70℃ 的溫度洗脫較好 ,否則將產(chǎn)生 “ 結(jié)柱 ” 。 1. 離子交換收集液的 低（初）流分 可以上柱再交換； 2. 高流分 收集 → 調(diào) → 結(jié)晶；