現(xiàn)代分子生物研究方法-資料下載頁
2025-01-16 09:55本頁面
【正文】 A分子的構(gòu)建 ? 1外源 DNA片段定向插入載體分子： 載體分子和待克隆的 DNA分子都是用同一對(duì) (NE1和 NE2) 切割，二者將按一種取向退火形成重組 DNA分子，保證外源DNA片段定向插入載體分子。 ? 若載體分子和外源 DNA插入片段不能產(chǎn)生出互補(bǔ)的粘性末端，則采用附加銜接物的辦法來提高平末端之間的連接效率。 2最佳連接反應(yīng) ? 經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的線性載體分子的自身不允許再環(huán)化。采用堿性磷酸酯酶處理由內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的線性載體分子，除去該 DNA的 5?P末端，而留下一個(gè) 5?OH基團(tuán)。當(dāng)插入了外源 DNA片段，其 5?為 P末端，從而能有效重組。 ? 在連接反應(yīng)中，使用正確的載體 DNA和外源 DNA的比例，是獲得高產(chǎn)重組轉(zhuǎn)化子的重要因素。 ? 用 λ噬菌體或柯斯質(zhì)粒作載體時(shí)，配制高比值的載體 DNA/供體 DNA的連接反應(yīng)體系有利于重組分子的形成。 ? 用質(zhì)粒作為克隆載體，其重組體分子由一個(gè)載體分子和一個(gè)供體 DNA片段連接環(huán)化而成，當(dāng)載體 DNA與供體 DNA的比值為 1時(shí)，有利于這類重組體分子的形成。 3重組體分子導(dǎo)人受體細(xì)胞的途徑 ? 將外源重組體分子導(dǎo)人受體細(xì)胞的主要途徑包括轉(zhuǎn)化 (或轉(zhuǎn)染 )、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射和電穿孔等。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)主要適用于細(xì)菌一類原核細(xì)胞和酵母等低等真核細(xì)胞，而顯微注射和電穿孔則主要應(yīng)用于高等動(dòng)物的真核細(xì)胞。在基因工程中有詳細(xì)介紹。 543 cDNA基因克隆 ? 真核生物基因組 DNA大，含有大量的重復(fù)序列和內(nèi)含子，難以直接分離到目的基因。通過 RTPCR可以部分解決。 ? 高等生物一般具有 3～ 5萬種左右不同的基因，在一定時(shí)間階段的單個(gè)細(xì)胞或組織中，僅有 15%左右的基因得以表達(dá)，產(chǎn)生出約 5000～ 10000種不同的 mRNA分子。 ? cDNA克隆的基本過程是通過一系列酶催作用，使總poly(A)mRNA轉(zhuǎn)變成雙鏈 cDNA群體并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主菌株細(xì)胞，構(gòu)成包含所有基因編碼序列的 cDNA基因文庫。 1高質(zhì)量 mRNA的制備 ? 可應(yīng)用 Promega PolyAT tract mRNA分離系統(tǒng)分離poly(A)mRNA。將用生物素標(biāo)識(shí)的寡聚 (dT)引物與細(xì)胞總 RNA共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場(chǎng)吸附通過寡聚 (dT)引物與抗生物素蛋白及強(qiáng)力微磁球相連的 mRNA。 2反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA ? mRNA5?——————————AAAA ? 互補(bǔ) 21CCC———————— TTTT20 ? 21GGG ? 所有包含 Poly(A)尾巴的 mRNA被反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。 ? 以 21和 20為引物做 PCR： ? 21－－－－－－－－－－ AAAA20互補(bǔ) ? 互補(bǔ) 21—————————————20 重組體分子的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化寄主菌株 ? 雙鏈 cDNA群體插入載體： ? 21－－－－－－－－－－ AAAA20互補(bǔ) ? 互補(bǔ) 21—————————————20 ? 設(shè)計(jì) 21時(shí)，讓其有酶 1的切點(diǎn)， 20有酶 2的切點(diǎn)，在質(zhì)粒載體上有相應(yīng)的切點(diǎn)，就可以定相將所有 PCR片段插入載體。 ? 轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主菌株細(xì)胞，構(gòu)成包含所有基因編碼序列的 cDNA基因文庫。 ? 載體分子有抗藥性基因，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的抗生素進(jìn)行篩選。 ? 經(jīng)過特殊處理的具有吸收外源 DNA能力的細(xì)菌細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。 ? 當(dāng)重組質(zhì)粒分子與感受態(tài)細(xì)胞混合，感受態(tài)細(xì)胞數(shù)量 》 重組質(zhì)粒分子時(shí)，在培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單菌落是由一個(gè)重組質(zhì)粒分子導(dǎo)入一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞后經(jīng)過繁殖而形成的。 ? 在組織和培養(yǎng)的細(xì)胞中，一個(gè)細(xì)胞中有些 mRNA可擁有數(shù)千個(gè)拷貝，而有些 mRNA只有幾個(gè)拷貝。根據(jù) mRNA分子含量的多寡，可以將 mRNA劃分為高豐度、中豐度和低豐度 3種不同的類型。 ? 從表中看出低豐度 mRNA，其總量約占總 mRNA的 30%，約有 11000個(gè)左右的不同種類的 mRNA。如果獲得 11000個(gè)克隆，得到每一種低豐度 mRNA的可能只有 30％，因此，為了獲得一個(gè)能夠代表全部低豐度mRNA序列的 cDNA基因文庫，必須的最低克隆數(shù) (理論值 )應(yīng)是11000/030≈37000。 ? 由于在實(shí)驗(yàn)中存在著取樣差異，有些序列容易被克隆，有些序列不容易被克隆，為了保證 cDNA文庫中能夠包含所有的序列，必須增加克隆的數(shù)目。為了使低豐度 mRNA的cDNA克隆達(dá)到 99%的期望率，需要篩選 170000個(gè)克隆。 544 克隆基因的分離 ? 1應(yīng)用核酸探針分離克隆目的基因 : 把 cDNA文庫轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，就可以與特異性的核酸探針進(jìn)行菌落雜交，以便篩選出具有目的基因的陽性克隆，這個(gè)過程叫作克隆基因的分離或篩選。 ? 應(yīng)用核酸探針分離目的基因的方法叫作核酸雜交篩選法。適用于大規(guī)模篩選。只要有合適的現(xiàn)成可用的核酸探針，就有可能從生物體的任何組織中分離到目的基因，也就能夠有效地檢測(cè)任何一種插入的外源DNA序列。 ?分離克隆基因的辦法很多，根據(jù)不同的需要再去學(xué)習(xí)具體的方法，這里就不作一一介紹了。
黨政相關(guān)相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1