【正文】 不規(guī)則。 側(cè)鏈 R基對(duì) α 螺旋有影響，帶同種電荷的 R基相互排斥。 Chapter 6 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 一 .蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系主要是：研究多肽鏈中不同部位的殘基與生物功能的關(guān)系。 進(jìn)行這方面的研究常用的方法有：同源蛋白質(zhì)氨基酸順序相似性分析、氨基酸殘基的化學(xué)修飾及切割實(shí)驗(yàn)等。 例 1 鐮刀形貧血病 ?患者血紅細(xì)胞合成了一種不正常的血紅蛋白（ HbS） ?它與正常的血紅蛋白（ HbA）的差別：僅僅在于 β鏈的 N末端第 6位殘基發(fā)生了變化 ?（ HbA）第 6位殘基是極性谷氨酸殘基，（ HbS）中換成了非極性的纈氨酸殘基 ?使血紅蛋白細(xì)胞收縮成鐮刀形，輸氧能力下降，易發(fā)生溶血 ?這說(shuō)明了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的高度統(tǒng)一性 例 2 一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活 體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)分子初合成時(shí)，常帶有抑制肽，呈無(wú)活性狀態(tài)，稱(chēng)為蛋白質(zhì)原 .蛋白質(zhì)原的部分肽鏈以特定的方式斷裂后，才變?yōu)榛钚苑肿?. 例：胰島素，在剛合成時(shí)，是一個(gè)比成熟的胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱(chēng)為 前胰島素原 ?前胰島素原 的 N末端有一段肽鏈，稱(chēng)為信號(hào)肽 . ?信號(hào)肽被切去，剩下的是 胰島素原 。 ?胰島素原 比胰島素分子多一段 C肽，只有當(dāng) C肽被切除后才成為有 51個(gè)殘基，分 A、 B兩條鏈的胰島素分子單體 . 同源蛋白：是指在不同有機(jī)體中實(shí)現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì) .同源蛋白中的一級(jí)結(jié)構(gòu)中有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來(lái)說(shuō)都是相同的，稱(chēng)為不變殘基；其他位置的氨基酸稱(chēng)可變殘基 .不同種屬的可變殘基有很大變化 .可用于判斷生物體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近 . 例：細(xì)胞色素 C ?60 個(gè)物種中，有 27 個(gè)位置上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構(gòu)象中發(fā)揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基 . ?可變殘基可能隨著進(jìn)化而變異，而且不同種屬的細(xì)胞色素 C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關(guān)系相關(guān)。親緣關(guān)系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進(jìn)化樹(shù)） . 例 3 同源蛋白 黃色： 不變殘基（ invariable residues） 藍(lán)色 ： 保守氨基酸（ conservative residues） 未標(biāo)記：可變殘基（ variable residues） 二 .蛋白質(zhì)的構(gòu)象與功能的關(guān)系 別構(gòu)效應(yīng)：又稱(chēng)變構(gòu)效應(yīng)，是指寡聚蛋白與配基結(jié)合，改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物活性改變的現(xiàn)象 .它是細(xì)胞內(nèi)最簡(jiǎn)單的調(diào)節(jié)方式 . 例：血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng) ?一個(gè)亞基與氧結(jié)合后，引起該亞基構(gòu)象改變 ?進(jìn)而引起另三個(gè)亞基的構(gòu)象改變 ?整個(gè)分子構(gòu)象改變 ?與氧的結(jié)合能力增加 Chapter 7 蛋白質(zhì)的性質(zhì)及分離純化 一 .蛋白質(zhì)的分子大小 蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子，相對(duì)分子質(zhì)量大于 10 40 000 000（煙草花葉病毒）． 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定方法 ? 此法首先利用化學(xué)分析方法測(cè)定蛋白質(zhì)分子中某一特殊成分的百分含量 ?然后，假定蛋白質(zhì)分子中該成分只有一個(gè)，據(jù)其百分含量可計(jì)算出最低相對(duì)分子質(zhì)量： ?最小相對(duì)分子質(zhì)量＝（已知成分的相對(duì)分子、原子質(zhì)量） /已知成分的百分含量 ?如果蛋白質(zhì)分子中所含已知成分不是一個(gè)單位，則真實(shí)相對(duì)分子質(zhì)量等于最小相對(duì)分子質(zhì)量的倍數(shù)。 2. 超離心法 ?在 60 000～ 80 000r/min的高速離心力作用下，蛋白質(zhì)分子會(huì)沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動(dòng) ?用光學(xué)方法測(cè)定界面移動(dòng)的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降速度 ?蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān) ?沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場(chǎng)中的沉降速度，用 S表示。 ?一個(gè) S單位，為 1 1013秒 ?相對(duì)分子質(zhì)量越大， S值越大 ?蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)： 1～ 200S 由沉降系數(shù) S可根據(jù)斯維得貝格 〔 Svedberg〕 方程計(jì)算蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量： M=RST/D〔 1－ vρ〕 R：氣體常數(shù) T：絕對(duì)溫度 D：擴(kuò)散系數(shù) ρ：溶劑的密度 ?凝膠過(guò)濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) ?一定型號(hào)的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外 ?洗脫時(shí)大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來(lái)，洗脫液體積小；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來(lái)穿去，歷程長(zhǎng)，后洗脫下來(lái)，洗脫體積大 ?測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖，商品名： Sephadex ?測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積 〔 Ve〕 ?以相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)（ logM）對(duì) Ve作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線 ?再測(cè)出未知樣品洗脫體積 〔 Ve〕 ?從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量 ?SDS:十二烷基硫酸鈉，變性劑 ?普通蛋白質(zhì)電泳的泳動(dòng)速率取決于荷質(zhì)比（凈電荷、大小、形狀） ?用 SDS和巰基乙醇（打開(kāi)二硫鍵）處理 ?蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與 SDS結(jié)合，形成 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物 ?不同蛋白質(zhì)分子的均帶負(fù)電（ SDS帶負(fù)電）；且荷質(zhì)比相同（蛋白質(zhì)分子大，結(jié)合 SDS多；分子小，結(jié)合 SDS少） ?不同蛋白質(zhì)分子具有相似的構(gòu)象 ?用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值對(duì)它們的遷移率作圖 ?測(cè)出待測(cè)樣品的遷移率 ?從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的相對(duì)分子質(zhì)量 ★ 影響遷移率的主要因素 ?凝膠的分子篩效應(yīng)對(duì)長(zhǎng)短不同的棒形分子會(huì) 產(chǎn) 生不同的阻力 〔 主要因素 〕 ?凝膠的濃度和交聯(lián)度 ?同一電泳條件下，分子小，受阻小，游動(dòng)快，遷移率大。相對(duì)分子質(zhì)量大者，遷移率小 ★ 優(yōu)點(diǎn)： 快速，樣品用量少，可同時(shí)測(cè)幾個(gè)樣品 缺點(diǎn)： 誤差大，約為 177。 10％（誤差主要來(lái)源于遷移距離的測(cè)量誤差） ★ 此方法只能測(cè)得 亞基肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量 二 . 蛋白質(zhì)的兩性離解和電泳現(xiàn)象 ?蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí) (Isoelectric point pI)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。 ?在不同的 pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在等電點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)；在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)。這種現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)電泳 (Electrophoresis)。 ?蛋白質(zhì)在等電點(diǎn) pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。 三 .蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) ?由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)等。 ?由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去 。 四 .蛋白質(zhì)的沉淀作用 ?蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。 ?改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì) ?在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來(lái)。 (1)在溫和條件下，通過(guò)改變?nèi)芤旱?pH或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。 (2) 在沉淀過(guò)程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒(méi)有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱(chēng)為非變性沉淀。 (3)可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等 。 (1)在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。 (2)由于沉淀過(guò)程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱(chēng)為變性沉淀。 (3)如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。 五 .蛋白質(zhì)的變性 蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)的變性 . 變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所具有的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強(qiáng)酸和強(qiáng)堿等 。 六 .蛋白質(zhì)的紫外吸收 ?大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 ?這三種氨基酸的在 280nm 附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在 280nm 附近顯示強(qiáng)的吸收。 ?利用這個(gè)性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。 七 .蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) ： ?雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色的復(fù)合物 ?含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣的反應(yīng) ?肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多顏色越深 ?受蛋白質(zhì)特異性影響小 ?蛋白質(zhì)定量測(cè)定；測(cè)定蛋白質(zhì)水解程度 ?酪氨酸的顯色反應(yīng)（酚羥基反應(yīng)） ?米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物 ?蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉淀，加熱后變成紅色 ?在蛋白質(zhì)溶液中加入 HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成 ?色氨酸的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)） ?鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸 ?明膠中不含色氨酸 ?精氨酸的反應(yīng)（胍基的反應(yīng)） ?精氨酸與 α萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴酸鈉）溶液中發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物 ?鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸 ?定量測(cè)定精氨酸 ?酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)（還原反應(yīng)） ?福林試劑：磷鉬酸 磷鎢酸 ? 與雙縮脲法結(jié)合 Lowry法 ?在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng) ?蛋白質(zhì) 銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物 ?靈敏度提高 100倍 靈敏度差 ?濃硝酸與酪氨酸、色氨酸的反應(yīng) ?生成黃色化合物 ?指甲、皮膚、毛發(fā) G250 ?本身為紅色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)呈藍(lán)色 ?與蛋白的親和力強(qiáng)，靈敏度高 ?11000微克 /毫升 本章小節(jié) 1. 蛋白質(zhì)的生物學(xué)作用：功能蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白 2. 蛋白質(zhì)的組成（元素組成、化學(xué)組成）及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 3. 二十種氨基酸的結(jié)構(gòu)、分類(lèi)及名稱(chēng)（三字縮寫(xiě)符、單字縮寫(xiě)符） 4. 氨基酸的重要理化性質(zhì)：兩性解離、 茚三酮 顯色、與 2,4二硝基氟苯（ DNFB）反應(yīng)、 與異硫氰酸苯酯（ PITC）的反應(yīng) 5. 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)：肽、肽鍵、活性多肽及一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 6. 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)：二級(jí)結(jié)構(gòu)單元（ ?螺旋、 ?折疊、 ?轉(zhuǎn)角、自由回轉(zhuǎn)）、三級(jí)與四級(jí)結(jié)構(gòu)（超二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、亞基）及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 7. 蛋白質(zhì)的性質(zhì)：大分子性質(zhì)、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定（離心法、凝膠過(guò)濾法、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法）、兩性解離（等電點(diǎn)、電泳、離子交換）、膠體性質(zhì)、蛋白質(zhì)沉淀（可逆沉淀、不可逆沉淀）、蛋白質(zhì)變性、紫外吸收及顏色反應(yīng) 8. 蛋白質(zhì)的分類(lèi)：按外形及組成分類(lèi)