【正文】 圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。普通的酶標(biāo)儀在 ~，新型號的酶標(biāo)儀上限拓寬達(dá) ，甚至更高。超出可測上限的 A值常以 *或 over或其它符號表示。應(yīng)注意可測范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標(biāo)儀的可測范圍為 ~，而其線性范圍僅 ~，這在定量 ELISA中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)予注意。 酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下，操作時室溫宜在 15~30℃，使用前先預(yù)熱儀器 1530分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。 測讀 A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如 OPD用 492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（ W1），第二次在不敏感波長（ W2），兩次測定間不移動 ELISA板的位置。例如 OPD用 492nm為 W1， 630nm為 W2，最終測得的 A值為兩者之差（ W1W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。 各種酶標(biāo)儀性能有所不 同，使用中應(yīng)詳細(xì)新聞記者說明書。 結(jié)果判斷 定性測定 定性測定的結(jié)果判斷是對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出 有 或 無 的簡單回答，分別用 陽性 、 陰性 表示。 陽性 表示該標(biāo)本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng)。 陰性 則為無反應(yīng)。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來表示反應(yīng)的強(qiáng)度，其實質(zhì)仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性、弱陽性更具定量意 義。 在間接法和夾心法 ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法 ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。 （ 1） 間接法和夾心法 這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標(biāo)本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在 ELSIA中，正常人血清反應(yīng)后?？沙霈F(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物（見 ）。在用肉眼判斷結(jié)果時，更宜用顯色深于陰性對照作為標(biāo)本陽性的指標(biāo)。 目視法簡捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應(yīng)該用比色計測定吸光值，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標(biāo)本（ sample， S）、陽性對照（ P）、和陰性對照（ N）的吸光值，然后進(jìn)行計算。計算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標(biāo)本與陰性對照比值法兩類。 a． 陽性判定值 陽性判定值（ cutoff value）一般為陰性對照 A 值加上一個特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。 用此法判斷結(jié)果要求實驗條件十分恒定，試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化，陽性和陰性的對照品應(yīng)符合一定的規(guī)格，須配用精密的儀器，并嚴(yán)格按規(guī)定操作。陽 性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標(biāo)本的實驗檢測而得到的?，F(xiàn)舉某種檢測 HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含 HBsAg的復(fù)鈣人血漿，陽性對照品 HBsAg的含量標(biāo)明為 P=9177。2ng/ml。每次試驗設(shè) 2 個陽性對照和 3個陰性對照。測得 A值后，先計算陰性對照 A值的平均數(shù)（ NCX）和陽性對照 A值的平均數(shù)（ PCX），兩個平均數(shù)的差（ PN）必須大于一個特定的數(shù)值（例 ），試驗才有效。 3個陰性對照 A值均應(yīng)≥ 179。 NCX，并≤ 179。NC X，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個陰性對 照重新計算 NCX；如有兩個陰性對照 A值超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算： 陽性判定值 =NCX+ 標(biāo)本 A值＞陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為陰性。應(yīng)注意的是，式中 試劑盒的常數(shù)，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。 根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會產(chǎn)生 試驗無效 的后果。 /陰性對照比值 在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（ S）和陰性對照（ N）的 A值后，計算 S/N值。也有寫作 P/N的，這里的 P不代表陽性 (positive)，而是病人（ patient）的縮寫，不應(yīng)誤解。為避免混淆，更宜用 S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出 S/N為陽性標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)多為各種測定所沿用。實際上每一測定系統(tǒng)應(yīng)該用實驗求出各自的 S/N的閾值。更應(yīng)注意的是， N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清。有的試劑盒中所設(shè)陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類試劑盒規(guī)，如 N（或其他數(shù)值），則按 ，否則將出現(xiàn)假陽性結(jié)果。 （ 2）競爭法 在競爭法 ELISA中，陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強(qiáng)度取決于反應(yīng)中酶結(jié)合物的濃度和加入競爭抑制物的量，一般調(diào)節(jié)陰性對照的吸光度在 ，此時反應(yīng)最為敏感。 競爭法 ELISA不易用自視判斷結(jié)果，因肉眼很難辨別弱陽性反應(yīng)與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計測定，讀出 S、 P和 N的吸光值。計算方法主要也有兩種，即陽性判定值法和抑制率法。 a. 陽性判定值法 與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同，但在計算公式中引入陽性對照 A值，現(xiàn)舉某種檢測抗 HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗 HBc的復(fù)鈣人血漿，陽性對照中抗 HBc含量為 125177。 100u/ml。每次試驗設(shè) 2個陽性對照和 3個陰性對照。測得 A值后，先計算陰性對照 A值的平均值（ NCX）和陽性對照 A值的平均數(shù)（ PCX），兩個平均數(shù)的差（ NP）必須大于一個特定的數(shù)值（例如 ） ,試驗才有效。 3個陰性對照 A值均應(yīng)小于 ，而且應(yīng)≥ 179。 NCX并≤ 179。 NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另 2個陰性對照重新計算179。 NCX；如有 2個陰性對照 A超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下 式計算： 陰性判定值 =179。 NCX+179。PCX 標(biāo)本 A值≤陽性判定值的反應(yīng)為陽性， A＞陽性判定值的反應(yīng)為陰性。 b. 抑制率法 抑制率表示標(biāo)本在競爭結(jié)合中標(biāo)本對陰性反應(yīng)顯色的抑制程度，按下式計算： 抑制率（ %） = （陰性對照 A值 標(biāo)本 A值）179。 100%/陰性對照 A值 一般規(guī)定抑制率≥ 50%為陽性，＜ 50%為陰性。 定量測定 ELSIA 操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 。測定大分子量物質(zhì)的夾心法 ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線最高點的吸光度可接近 ，繪制時常用半對數(shù)紙，以檢測物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈 S 形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區(qū)域。甲胎蛋白質(zhì) ELISA 測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線示例見圖 41。 測定小分子量物質(zhì)常用競爭法（參見 ），其標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負(fù)相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。 ELISA 測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線示例見圖 42。注意圖中橫坐標(biāo)為對數(shù)關(guān)系， 這更有利于測定系統(tǒng)的表達(dá) . ELISA技術(shù)講座六 質(zhì)量控制 有關(guān)質(zhì)量控制問題 從 1949年美國 College of American Pathologists（簡稱 CAP）首先開始研究臨床實驗室室內(nèi)質(zhì)量控制（簡稱質(zhì)控）問題，美國學(xué)者 Levery和 Jenning于 1950年發(fā)表第一篇關(guān)于使用質(zhì)控圖的實驗室室內(nèi)質(zhì)控，臨床檢驗實驗室的室內(nèi)質(zhì)控工作正式拉序幕。 到 70 年代，實驗室質(zhì)量控制進(jìn)入一個新的階段 全面質(zhì)量管理，推行 Good Laboratory Parctice（簡稱 GLP）。進(jìn)入 80 年代末期， GLP 的統(tǒng) 一標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生了，發(fā)展到 認(rèn)證實驗室 管理階段。 全面質(zhì)量管理的宗旨在于預(yù)防差錯的產(chǎn)生。質(zhì)控圖的統(tǒng)計學(xué)質(zhì)控的目的是檢出差錯。統(tǒng)計學(xué)的實驗室室內(nèi)質(zhì)控是全面質(zhì)量管理中的一個重要環(huán)節(jié)。 本章節(jié)主要介紹免疫學(xué)檢驗的統(tǒng)計學(xué)室內(nèi)質(zhì)控方法。因為 ELISA是目前臨床上最常用的一種免疫學(xué)檢驗方法，就以 ELISA檢驗為例，介紹一下有關(guān)問題。 衛(wèi)生部臨床檢驗中心免疫質(zhì)控室從 1988 年開始在全國范圍內(nèi)開展乙肝標(biāo)志物檢驗的質(zhì)量評價活動，一直采用這一套質(zhì)量評價方法，并在實踐中不斷實踐、提高和完善，希望能找出一條適合中國國情的，行之有效的質(zhì) 量管理的道路。 基本概念 質(zhì)量控制（ Quaility Control,） 質(zhì)量控制是監(jiān)視全過程，排除誤差，防止變化，維持標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀的一個管理過程。這一過程是通過一個反饋環(huán)路進(jìn)行的。 1）確定控制的對象； 2）規(guī)定控制對象的標(biāo)準(zhǔn)（預(yù)期值）； 3）制定或選擇控制方法和手段； 3）測量實際數(shù)據(jù)； 4）比較或較對實際數(shù)據(jù)與預(yù)期值之間的差異，并說明產(chǎn)生這一差異的原因。超出預(yù) 定誤差范圍，報警系發(fā)出信號，反饋通道中斷。 5）采取行動，解決差異?；謴?fù)原狀（原標(biāo)準(zhǔn)狀 態(tài)）的手段發(fā)揮作用。 質(zhì)量控制主要采用質(zhì)控圖進(jìn)行。質(zhì)控圖是把某一檢驗的性能數(shù)據(jù)與所計算出來的預(yù)期的 控制限 進(jìn)行比較的圖。這種性能數(shù)據(jù)是在按規(guī)程正常進(jìn)行時，按時間順序而抽選出來的，其目的是檢測檢驗過程中變異的 可追查 性原因。 可追逆 性的誤差原因，是指除去隨機(jī)誤差以外的其他原因。 控制限 是通過統(tǒng)計計算出來的，在后我們將詳細(xì)介紹（見 ）。 誤差 實驗誤差分為三種：系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差和過失誤差。 系統(tǒng)誤差是指一系列測定結(jié)果與真值或靶值存在有同一傾向的誤差，有明顯的規(guī)律性，可在一 定條件下重復(fù)出現(xiàn)，是可以通過質(zhì)控預(yù)防和校正的。 隨機(jī)誤差又稱偶然誤差，是一種偶然的、未能預(yù)料到的誤差，是難以避免和校正的誤差。檢驗工作中隨機(jī)誤差的分布符合正態(tài)分布規(guī)律。 過失誤差是人為的責(zé)任誤差。通過加強(qiáng)實驗室管理和開展質(zhì)量控制工作是可以避免的。 正態(tài)分布及標(biāo)準(zhǔn)差 ELISA 試驗中，檢驗同一樣本達(dá) 20 次以上時，就會發(fā)現(xiàn)這組數(shù)據(jù)（指測定結(jié)果的吸光值）分布在均值兩側(cè)，大部分集中在均值附近。如果以測定值為橫坐標(biāo)，以出現(xiàn)的頻率為縱坐標(biāo)作圖，就可繪出一個呈鐘形的曲線圖。如圖 51，鐘頂處為均值，其他值以均 值為中心對稱分布，這就是正態(tài)分布。 正態(tài)曲線以下的面積稱概率，常用樣本的均數(shù)（ X）和標(biāo)準(zhǔn)差（ SD）來表示，其計算方法如下： 均值、標(biāo)準(zhǔn)差和概率的關(guān)系如下： X177。 1SD，概率 X177。 2SD，概率 X177。 3SD，概率 換言之，當(dāng) ELSIA 檢測同一樣本達(dá)一定次數(shù)后所得的一組數(shù)據(jù)，其中靠近均值（ X）的177。 1SD 范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)，占該組數(shù)據(jù)的 68%，在 X177。 2SD范圍內(nèi)分布的數(shù)據(jù)占總體的 95%，在 X177。 3SD 范圍內(nèi)分布的數(shù)據(jù)占總體的 99%。當(dāng)我們要求檢驗結(jié)果在 X177。 2SD范 圍內(nèi)為合格時，將有 95%的數(shù)據(jù)可能合格。 真值 用確切的、最理想的決定性方法測得的值，稱為真值。真值一般是測不到的。通過可靠的決定性方法測出的值，稱為靶值，通常用靶值來表示真值的大小。 準(zhǔn)確度（ accuracy） 是指測定結(jié)果與真值（或靶值）接近的程度。準(zhǔn)確度不能以數(shù)字表示，往往用不準(zhǔn)確度來衡量。測定結(jié)果與靶值的偏離程度稱為偏差，它表示該項檢驗的不準(zhǔn)確度。 絕對偏差 =檢驗的均值 真值（或靶值） 相對偏差 =絕對偏差真值247。（或靶值）179。 100% 精密度（ Precision） 是指對同一樣本重復(fù)測定時，每次測定結(jié)果與平均值的接近程度，即重復(fù)測定值之間 的符合程度。 標(biāo)準(zhǔn)品 國際標(biāo)準(zhǔn)品 由 WHO 或相應(yīng)組織標(biāo)定的，用肯定的、公認(rèn)的、準(zhǔn)確的物理或化學(xué)方法測定的定值材料。 國際生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)生物學(xué)反應(yīng)由 WHO 或相應(yīng)組織標(biāo)定的國際活性單位的材料。 參考標(biāo)準(zhǔn)血清 國家標(biāo)準(zhǔn)化組織根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的法定材料?？捎糜阼b定儀器和鑒定方法準(zhǔn)確性。 臨床決定性水平（ clinical decision leuel） 當(dāng)某個被測物的濃度達(dá)到某一水平時，臨床 醫(yī)師必須采用醫(yī)療措施。被測物的這濃度稱為臨床決定性水平。 質(zhì)量控制血清 質(zhì)控血清是已有靶值的血清，在每次的常規(guī)檢驗中加入一份或數(shù)份，通過所得結(jié)果來了解本次檢驗的情況。質(zhì)控血清檢驗的結(jié)果如能控制其誤差在一定范圍內(nèi)，就說明該檢驗沒有發(fā)生不允許的誤差。如果出現(xiàn)超過允許誤差范圍的異常結(jié)果，提示該檢驗不合格，應(yīng)尋找原因，糾正后，重檢待測標(biāo)本。因此質(zhì)控血清在質(zhì)控工作中起重要作用。 質(zhì)控血清的使用 衛(wèi)生部臨床檢驗中心制備的乙肝標(biāo)志物質(zhì)控血清，可以在 20℃保持半年定值不變。冰凍狀態(tài)融化使用時，應(yīng)先混勻， 未用完部分可在 4℃保存 5 天。不宜反復(fù)冰融或自行分裝。開展某項檢驗的室內(nèi)質(zhì)控工作需要的質(zhì)控血清，一般按 36 個月用量準(zhǔn)備。自制的不定值質(zhì)控血清，在一批質(zhì)控血清將用完之前，需準(zhǔn)備下一批質(zhì)控血清。質(zhì)控血清要求性能穩(wěn)定，較長期內(nèi)效價不變，其理化性質(zhì)應(yīng)與病人樣本相近，這樣才能有效地起到監(jiān)測作用。 臨界值質(zhì)控血清 質(zhì)控制血清分定值和未定值兩種。如只用一份質(zhì)控血清定值，一般定在正常值與異常值交界點上，定性測定時處于弱陽性水平，稱為臨界值。乙肝標(biāo)志物臨界值的制定，應(yīng)按臨床要求，為臨床提供統(tǒng)一的判