【正文】 圍視各酶標儀的性能而不同。普通的酶標儀在 ~，新型號的酶標儀上限拓寬達 ，甚至更高。超出可測上限的 A值常以 *或 over或其它符號表示。應注意可測范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標儀的可測范圍為 ~，而其線性范圍僅 ~，這在定量 ELISA中制作標準曲線時應予注意。 酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在 15~30℃，使用前先預熱儀器 1530分鐘，測讀結果更穩(wěn)定。 測讀 A值時，要選用產物的敏感吸收峰，如 OPD用 492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（ W1），第二次在不敏感波長（ W2），兩次測定間不移動 ELISA板的位置。例如 OPD用 492nm為 W1， 630nm為 W2，最終測得的 A值為兩者之差（ W1W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。 各種酶標儀性能有所不 同，使用中應詳細新聞記者說明書。 結果判斷 定性測定 定性測定的結果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出 有 或 無 的簡單回答，分別用 陽性 、 陰性 表示。 陽性 表示該標本在該測定系統(tǒng)中有反應。 陰性 則為無反應。用定性判斷法也可得到半定量結果，即用滴度來表示反應的強度，其實質仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意 義。 在間接法和夾心法 ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法 ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應的結果判斷方法不同，分述于下。 （ 1） 間接法和夾心法 這類反應的定性結果可以用肉眼判斷。目視標本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在 ELSIA中，正常人血清反應后?？沙霈F呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應為不含受檢物的正常血清或類似物（見 ）。在用肉眼判斷結果時，更宜用顯色深于陰性對照作為標本陽性的指標。 目視法簡捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應該用比色計測定吸光值，這樣可以得到客觀的數據。先讀出標本（ sample， S）、陽性對照（ P）、和陰性對照（ N）的吸光值，然后進行計算。計算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標本與陰性對照比值法兩類。 a． 陽性判定值 陽性判定值（ cutoff value）一般為陰性對照 A 值加上一個特定的常數，以此作為判斷結果陽性或陰性的標準。 用此法判斷結果要求實驗條件十分恒定，試劑的制備必須標準化，陽性和陰性的對照品應符合一定的規(guī)格，須配用精密的儀器，并嚴格按規(guī)定操作。陽 性判定值公式中的常數是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標本的實驗檢測而得到的?，F舉某種檢測 HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含 HBsAg的復鈣人血漿，陽性對照品 HBsAg的含量標明為 P=9177。2ng/ml。每次試驗設 2 個陽性對照和 3個陰性對照。測得 A值后，先計算陰性對照 A值的平均數（ NCX）和陽性對照 A值的平均數（ PCX），兩個平均數的差（ PN）必須大于一個特定的數值（例 ），試驗才有效。 3個陰性對照 A值均應≥ 179。 NCX，并≤ 179。NC X，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個陰性對 照重新計算 NCX；如有兩個陰性對照 A值超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算： 陽性判定值 =NCX+ 標本 A值＞陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為陰性。應注意的是，式中 試劑盒的常數，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。 根據以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質控作用，試劑變質和操作不當均會產生 試驗無效 的后果。 /陰性對照比值 在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標本（ S）和陰性對照（ N）的 A值后，計算 S/N值。也有寫作 P/N的，這里的 P不代表陽性 (positive)，而是病人（ patient）的縮寫，不應誤解。為避免混淆，更宜用 S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出 S/N為陽性標準，現多為各種測定所沿用。實際上每一測定系統(tǒng)應該用實驗求出各自的 S/N的閾值。更應注意的是， N所代表的陰性對照是不含受檢物質的人血清。有的試劑盒中所設陰性對照為不含蛋白質或蛋白質含量較底的緩沖液，以致反應后產生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類試劑盒規(guī)，如 N（或其他數值），則按 ，否則將出現假陽性結果。 （ 2）競爭法 在競爭法 ELISA中，陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強度取決于反應中酶結合物的濃度和加入競爭抑制物的量，一般調節(jié)陰性對照的吸光度在 ，此時反應最為敏感。 競爭法 ELISA不易用自視判斷結果，因肉眼很難辨別弱陽性反應與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計測定，讀出 S、 P和 N的吸光值。計算方法主要也有兩種，即陽性判定值法和抑制率法。 a. 陽性判定值法 與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同，但在計算公式中引入陽性對照 A值，現舉某種檢測抗 HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗 HBc的復鈣人血漿，陽性對照中抗 HBc含量為 125177。 100u/ml。每次試驗設 2個陽性對照和 3個陰性對照。測得 A值后，先計算陰性對照 A值的平均值（ NCX）和陽性對照 A值的平均數（ PCX），兩個平均數的差（ NP）必須大于一個特定的數值（例如 ） ,試驗才有效。 3個陰性對照 A值均應小于 ，而且應≥ 179。 NCX并≤ 179。 NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另 2個陰性對照重新計算179。 NCX；如有 2個陰性對照 A超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下 式計算： 陰性判定值 =179。 NCX+179。PCX 標本 A值≤陽性判定值的反應為陽性， A＞陽性判定值的反應為陰性。 b. 抑制率法 抑制率表示標本在競爭結合中標本對陰性反應顯色的抑制程度，按下式計算： 抑制率（ %） = （陰性對照 A值 標本 A值）179。 100%/陰性對照 A值 一般規(guī)定抑制率≥ 50%為陽性，＜ 50%為陰性。 定量測定 ELSIA 操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線 。測定大分子量物質的夾心法 ELISA，標準曲線的范圍一般較寬，曲線最高點的吸光度可接近 ，繪制時常用半對數紙，以檢測物的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈 S 形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區(qū)域。甲胎蛋白質 ELISA 測定的標準曲線示例見圖 41。 測定小分子量物質常用競爭法（參見 ），其標準曲線中吸光度與受檢物質的濃度呈負相關。標準曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。 ELISA 測定的標準曲線示例見圖 42。注意圖中橫坐標為對數關系， 這更有利于測定系統(tǒng)的表達 . ELISA技術講座六 質量控制 有關質量控制問題 從 1949年美國 College of American Pathologists（簡稱 CAP）首先開始研究臨床實驗室室內質量控制（簡稱質控）問題，美國學者 Levery和 Jenning于 1950年發(fā)表第一篇關于使用質控圖的實驗室室內質控，臨床檢驗實驗室的室內質控工作正式拉序幕。 到 70 年代，實驗室質量控制進入一個新的階段 全面質量管理，推行 Good Laboratory Parctice（簡稱 GLP）。進入 80 年代末期， GLP 的統(tǒng) 一標準產生了，發(fā)展到 認證實驗室 管理階段。 全面質量管理的宗旨在于預防差錯的產生。質控圖的統(tǒng)計學質控的目的是檢出差錯。統(tǒng)計學的實驗室室內質控是全面質量管理中的一個重要環(huán)節(jié)。 本章節(jié)主要介紹免疫學檢驗的統(tǒng)計學室內質控方法。因為 ELISA是目前臨床上最常用的一種免疫學檢驗方法，就以 ELISA檢驗為例，介紹一下有關問題。 衛(wèi)生部臨床檢驗中心免疫質控室從 1988 年開始在全國范圍內開展乙肝標志物檢驗的質量評價活動，一直采用這一套質量評價方法，并在實踐中不斷實踐、提高和完善，希望能找出一條適合中國國情的，行之有效的質 量管理的道路。 基本概念 質量控制（ Quaility Control,） 質量控制是監(jiān)視全過程，排除誤差，防止變化，維持標準化現狀的一個管理過程。這一過程是通過一個反饋環(huán)路進行的。 1）確定控制的對象； 2）規(guī)定控制對象的標準（預期值）； 3）制定或選擇控制方法和手段； 3）測量實際數據； 4）比較或較對實際數據與預期值之間的差異，并說明產生這一差異的原因。超出預 定誤差范圍，報警系發(fā)出信號，反饋通道中斷。 5）采取行動，解決差異。恢復原狀（原標準狀 態(tài)）的手段發(fā)揮作用。 質量控制主要采用質控圖進行。質控圖是把某一檢驗的性能數據與所計算出來的預期的 控制限 進行比較的圖。這種性能數據是在按規(guī)程正常進行時，按時間順序而抽選出來的，其目的是檢測檢驗過程中變異的 可追查 性原因。 可追逆 性的誤差原因，是指除去隨機誤差以外的其他原因。 控制限 是通過統(tǒng)計計算出來的，在后我們將詳細介紹（見 ）。 誤差 實驗誤差分為三種：系統(tǒng)誤差、隨機誤差和過失誤差。 系統(tǒng)誤差是指一系列測定結果與真值或靶值存在有同一傾向的誤差，有明顯的規(guī)律性，可在一 定條件下重復出現，是可以通過質控預防和校正的。 隨機誤差又稱偶然誤差，是一種偶然的、未能預料到的誤差，是難以避免和校正的誤差。檢驗工作中隨機誤差的分布符合正態(tài)分布規(guī)律。 過失誤差是人為的責任誤差。通過加強實驗室管理和開展質量控制工作是可以避免的。 正態(tài)分布及標準差 ELISA 試驗中，檢驗同一樣本達 20 次以上時，就會發(fā)現這組數據（指測定結果的吸光值）分布在均值兩側，大部分集中在均值附近。如果以測定值為橫坐標，以出現的頻率為縱坐標作圖，就可繪出一個呈鐘形的曲線圖。如圖 51，鐘頂處為均值，其他值以均 值為中心對稱分布，這就是正態(tài)分布。 正態(tài)曲線以下的面積稱概率，常用樣本的均數（ X）和標準差（ SD）來表示，其計算方法如下： 均值、標準差和概率的關系如下： X177。 1SD，概率 X177。 2SD，概率 X177。 3SD，概率 換言之，當 ELSIA 檢測同一樣本達一定次數后所得的一組數據，其中靠近均值（ X）的177。 1SD 范圍內的數據，占該組數據的 68%，在 X177。 2SD范圍內分布的數據占總體的 95%，在 X177。 3SD 范圍內分布的數據占總體的 99%。當我們要求檢驗結果在 X177。 2SD范 圍內為合格時，將有 95%的數據可能合格。 真值 用確切的、最理想的決定性方法測得的值，稱為真值。真值一般是測不到的。通過可靠的決定性方法測出的值，稱為靶值，通常用靶值來表示真值的大小。 準確度（ accuracy） 是指測定結果與真值（或靶值）接近的程度。準確度不能以數字表示，往往用不準確度來衡量。測定結果與靶值的偏離程度稱為偏差，它表示該項檢驗的不準確度。 絕對偏差 =檢驗的均值 真值（或靶值） 相對偏差 =絕對偏差真值247。（或靶值）179。 100% 精密度（ Precision） 是指對同一樣本重復測定時，每次測定結果與平均值的接近程度，即重復測定值之間 的符合程度。 標準品 國際標準品 由 WHO 或相應組織標定的，用肯定的、公認的、準確的物理或化學方法測定的定值材料。 國際生物學活性標準品根據生物學反應由 WHO 或相應組織標定的國際活性單位的材料。 參考標準血清 國家標準化組織根據國際標準化生產的法定材料。可用于鑒定儀器和鑒定方法準確性。 臨床決定性水平（ clinical decision leuel） 當某個被測物的濃度達到某一水平時，臨床 醫(yī)師必須采用醫(yī)療措施。被測物的這濃度稱為臨床決定性水平。 質量控制血清 質控血清是已有靶值的血清，在每次的常規(guī)檢驗中加入一份或數份，通過所得結果來了解本次檢驗的情況。質控血清檢驗的結果如能控制其誤差在一定范圍內，就說明該檢驗沒有發(fā)生不允許的誤差。如果出現超過允許誤差范圍的異常結果，提示該檢驗不合格，應尋找原因，糾正后，重檢待測標本。因此質控血清在質控工作中起重要作用。 質控血清的使用 衛(wèi)生部臨床檢驗中心制備的乙肝標志物質控血清，可以在 20℃保持半年定值不變。冰凍狀態(tài)融化使用時，應先混勻， 未用完部分可在 4℃保存 5 天。不宜反復冰融或自行分裝。開展某項檢驗的室內質控工作需要的質控血清，一般按 36 個月用量準備。自制的不定值質控血清，在一批質控血清將用完之前，需準備下一批質控血清。質控血清要求性能穩(wěn)定，較長期內效價不變，其理化性質應與病人樣本相近，這樣才能有效地起到監(jiān)測作用。 臨界值質控血清 質控制血清分定值和未定值兩種。如只用一份質控血清定值，一般定在正常值與異常值交界點上，定性測定時處于弱陽性水平，稱為臨界值。乙肝標志物臨界值的制定，應按臨床要求，為臨床提供統(tǒng)一的判