【正文】 如只用一份質(zhì)控血清定值，一般定在正常值與異常值交界點(diǎn)上，定性測(cè)定時(shí)處于弱陽(yáng)性水平，稱為臨界值。質(zhì)控血清要求性能穩(wěn)定，較長(zhǎng)期內(nèi)效價(jià)不變，其理化性質(zhì)應(yīng)與病人樣本相近，這樣才能有效地起到監(jiān)測(cè)作用。開(kāi)展某項(xiàng)檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控工作需要的質(zhì)控血清，一般按 36 個(gè)月用量準(zhǔn)備。冰凍狀態(tài)融化使用時(shí)，應(yīng)先混勻， 未用完部分可在 4℃保存 5 天。因此質(zhì)控血清在質(zhì)控工作中起重要作用。質(zhì)控血清檢驗(yàn)的結(jié)果如能控制其誤差在一定范圍內(nèi)，就說(shuō)明該檢驗(yàn)沒(méi)有發(fā)生不允許的誤差。被測(cè)物的這濃度稱為臨床決定性水平?？捎糜阼b定儀器和鑒定方法準(zhǔn)確性。 國(guó)際生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)生物學(xué)反應(yīng)由 WHO 或相應(yīng)組織標(biāo)定的國(guó)際活性單位的材料。 100% 精密度（ Precision） 是指對(duì)同一樣本重復(fù)測(cè)定時(shí)，每次測(cè)定結(jié)果與平均值的接近程度，即重復(fù)測(cè)定值之間 的符合程度。 絕對(duì)偏差 =檢驗(yàn)的均值 真值（或靶值） 相對(duì)偏差 =絕對(duì)偏差真值247。準(zhǔn)確度不能以數(shù)字表示，往往用不準(zhǔn)確度來(lái)衡量。通過(guò)可靠的決定性方法測(cè)出的值，稱為靶值，通常用靶值來(lái)表示真值的大小。 真值 用確切的、最理想的決定性方法測(cè)得的值，稱為真值。當(dāng)我們要求檢驗(yàn)結(jié)果在 X177。 2SD范圍內(nèi)分布的數(shù)據(jù)占總體的 95%，在 X177。 3SD，概率 換言之，當(dāng) ELSIA 檢測(cè)同一樣本達(dá)一定次數(shù)后所得的一組數(shù)據(jù)，其中靠近均值（ X）的177。 1SD，概率 X177。如圖 51，鐘頂處為均值，其他值以均 值為中心對(duì)稱分布，這就是正態(tài)分布。 正態(tài)分布及標(biāo)準(zhǔn)差 ELISA 試驗(yàn)中，檢驗(yàn)同一樣本達(dá) 20 次以上時(shí)，就會(huì)發(fā)現(xiàn)這組數(shù)據(jù)（指測(cè)定結(jié)果的吸光值）分布在均值兩側(cè)，大部分集中在均值附近。 過(guò)失誤差是人為的責(zé)任誤差。 隨機(jī)誤差又稱偶然誤差，是一種偶然的、未能預(yù)料到的誤差，是難以避免和校正的誤差。 誤差 實(shí)驗(yàn)誤差分為三種：系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差和過(guò)失誤差。 可追逆 性的誤差原因，是指除去隨機(jī)誤差以外的其他原因。質(zhì)控圖是把某一檢驗(yàn)的性能數(shù)據(jù)與所計(jì)算出來(lái)的預(yù)期的 控制限 進(jìn)行比較的圖?；謴?fù)原狀（原標(biāo)準(zhǔn)狀 態(tài)）的手段發(fā)揮作用。超出預(yù) 定誤差范圍，報(bào)警系發(fā)出信號(hào)，反饋通道中斷。這一過(guò)程是通過(guò)一個(gè)反饋環(huán)路進(jìn)行的。 衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心免疫質(zhì)控室從 1988 年開(kāi)始在全國(guó)范圍內(nèi)開(kāi)展乙肝標(biāo)志物檢驗(yàn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，一直采用這一套質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，并在實(shí)踐中不斷實(shí)踐、提高和完善，希望能找出一條適合中國(guó)國(guó)情的，行之有效的質(zhì) 量管理的道路。 本章節(jié)主要介紹免疫學(xué)檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)室內(nèi)質(zhì)控方法。質(zhì)控圖的統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的目的是檢出差錯(cuò)。進(jìn)入 80 年代末期， GLP 的統(tǒng) 一標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生了，發(fā)展到 認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室 管理階段。注意圖中橫坐標(biāo)為對(duì)數(shù)關(guān)系， 這更有利于測(cè)定系統(tǒng)的表達(dá) . ELISA技術(shù)講座六 質(zhì)量控制 有關(guān)質(zhì)量控制問(wèn)題 從 1949年美國(guó) College of American Pathologists（簡(jiǎn)稱 CAP）首先開(kāi)始研究臨床實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制（簡(jiǎn)稱質(zhì)控）問(wèn)題，美國(guó)學(xué)者 Levery和 Jenning于 1950年發(fā)表第一篇關(guān)于使用質(zhì)控圖的實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控，臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)質(zhì)控工作正式拉序幕。標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。甲胎蛋白質(zhì) ELISA 測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線示例見(jiàn)圖 41。 定量測(cè)定 ELSIA 操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測(cè)定中，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 。 b. 抑制率法 抑制率表示標(biāo)本在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合中標(biāo)本對(duì)陰性反應(yīng)顯色的抑制程度，按下式計(jì)算： 抑制率（ %） = （陰性對(duì)照 A值 標(biāo)本 A值）179。 NCX+179。 NCX；如有 2個(gè)陰性對(duì)照 A超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。 NCX并≤ 179。測(cè)得 A值后，先計(jì)算陰性對(duì)照 A值的平均值（ NCX）和陽(yáng)性對(duì)照 A值的平均數(shù)（ PCX），兩個(gè)平均數(shù)的差（ NP）必須大于一個(gè)特定的數(shù)值（例如 ） ,試驗(yàn)才有效。 100u/ml。 a. 陽(yáng)性判定值法 與間接法和夾心法中的陽(yáng)性判定值法基本相同，但在計(jì)算公式中引入陽(yáng)性對(duì)照 A值，現(xiàn)舉某種檢測(cè)抗 HBc的試劑盒為例。 競(jìng)爭(zhēng)法 ELISA不易用自視判斷結(jié)果，因肉眼很難辨別弱陽(yáng)性反應(yīng)與陰性對(duì)照的顯色差異，一般均用比色計(jì)測(cè)定，讀出 S、 P和 N的吸光值。 （ 2）競(jìng)爭(zhēng)法 在競(jìng)爭(zhēng)法 ELISA中，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。有的試劑盒中所設(shè)陰性對(duì)照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。實(shí)際上每一測(cè)定系統(tǒng)應(yīng)該用實(shí)驗(yàn)求出各自的 S/N的閾值。為避免混淆，更宜用 S/N表示。在得出標(biāo)本（ S）和陰性對(duì)照（ N）的 A值后，計(jì)算 S/N值。 根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照也起到試驗(yàn)的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會(huì)產(chǎn)生 試驗(yàn)無(wú)效 的后果。陽(yáng)性判定值按下式計(jì)算： 陽(yáng)性判定值 =NCX+ 標(biāo)本 A值＞陽(yáng)性判定值的為陽(yáng)性，小于陽(yáng)性判定值的為陰性。 NCX，并≤ 179。測(cè)得 A值后，先計(jì)算陰性對(duì)照 A值的平均數(shù)（ NCX）和陽(yáng)性對(duì)照 A值的平均數(shù)（ PCX），兩個(gè)平均數(shù)的差（ PN）必須大于一個(gè)特定的數(shù)值（例 ），試驗(yàn)才有效。2ng/ml?，F(xiàn)舉某種檢測(cè) HBsAg的試劑盒為例。 用此法判斷結(jié)果要求實(shí)驗(yàn)條件十分恒定，試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化，陽(yáng)性和陰性的對(duì)照品應(yīng)符合一定的規(guī)格，須配用精密的儀器，并嚴(yán)格按規(guī)定操作。計(jì)算方法有多種，大致可分為陽(yáng)性判定值法和標(biāo)本與陰性對(duì)照比值法兩類。在條件許可下，應(yīng)該用比色計(jì)測(cè)定吸光值，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。在用肉眼判斷結(jié)果時(shí)，更宜用顯色深于陰性對(duì)照作為標(biāo)本陽(yáng)性的指標(biāo)。但在 ELSIA中，正常人血清反應(yīng)后?？沙霈F(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實(shí)驗(yàn)的條件不同而異，因此實(shí)驗(yàn)中必須加測(cè)陰性對(duì)照。 （ 1） 間接法和夾心法 這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。在競(jìng)爭(zhēng)法 ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意 義。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來(lái)表示反應(yīng)的強(qiáng)度，其實(shí)質(zhì)仍是一個(gè)定性試驗(yàn)。 陽(yáng)性 表示該標(biāo)本在該測(cè)定系統(tǒng)中有反應(yīng)。 各種酶標(biāo)儀性能有所不 同，使用中應(yīng)詳細(xì)新聞?dòng)浾哒f(shuō)明書(shū)。例如 OPD用 492nm為 W1， 630nm為 W2，最終測(cè)得的 A值為兩者之差（ W1W2）。 測(cè)讀 A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如 OPD用 492nm波長(zhǎng)。應(yīng)注意可測(cè)范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測(cè)范圍，比如某一酶標(biāo)儀的可測(cè)范圍為 ~，而其線性范圍僅 ~，這在定量 ELISA中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)予注意。普通的酶標(biāo)儀在 ~，新型號(hào)的酶標(biāo)儀上限拓寬達(dá) ，甚至更高。 （ ~）在之間。舉例說(shuō)，若某孔測(cè)得的 A值為 ，則該孔相對(duì)于空氣的真實(shí) A值應(yīng)為 177。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到 ，準(zhǔn)確性為177。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標(biāo)儀。 酶標(biāo)比色儀 酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指專用于測(cè)讀 ELISA結(jié)果吸光度的光度計(jì)。 比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度（ oplical density， OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（ absorbence，A），兩者含義相同。 比色時(shí)應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過(guò)程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。以軟板為載體的試驗(yàn)，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn) 96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。此外，各類酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)（ 450nm）測(cè)讀吸光值。 TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（ SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。 OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。 OPD底物顯色一般在室外溫或 37℃反應(yīng) 2030 分鐘后即不再加深，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。在定量測(cè)定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。在一定時(shí)間內(nèi)，陰 性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。 顯色和比色 顯色 顯色是 ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時(shí)附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動(dòng)淋洗，持續(xù)沖洗 2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡 2 分鐘，吸干即可。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫 20，其濃度可在 %%之間，高于 %時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長(zhǎng)浸 泡時(shí)間。 洗滌的方式除某些 ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種，過(guò)程如下： （ 1）浸泡式 ； （將洗滌液注滿板孔后，即甩去）； ，即將洗滌液注滿板孔，放置 12分鐘，間歇搖動(dòng)，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。 ELSIA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。室溫溫育時(shí)， ELISA 板只要平 置于操作臺(tái)上即可。無(wú)論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。若用保溫箱， ELISA 板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將 ELISA板放在濕紗布上。 保溫的方式除有的 ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將 ELISA板置于水浴箱中， ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速 平衡?？乖贵w反應(yīng) 4℃更為徹底，在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中過(guò)夜，以形成最多的沉淀。在建立 ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在 37℃經(jīng) 12小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。 溫育常采用的溫度有 43℃、 37℃、室溫和 4℃（冰箱溫度）等。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和 時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱為溫育 (incubation)，有人稱之為孵育，在 ELISA中似不恰當(dāng)。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。有此測(cè)定（如間接法 ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。 加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。 加樣 在 ELISA中一般有 3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。 ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無(wú)菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑（見(jiàn) ）?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測(cè)。 一般說(shuō)來(lái)，在 5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于 4℃，超過(guò)一周測(cè)定的需低溫冰存。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性 HRP，也會(huì)產(chǎn)生假 陽(yáng)性反應(yīng)。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物 質(zhì)，以 HRP為標(biāo)記的 ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。除特殊情況外，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測(cè)標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。本文將敘述板式ELISA 各個(gè)操作步驟的注意要點(diǎn)，珠式、管式及磁性球 ELSIA，國(guó)外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用，兩者均有詳細(xì)的使用說(shuō)明，嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。 ELISA 技術(shù)講座五 操作要點(diǎn) 優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證 ELISA 檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。在對(duì)照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱，在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可對(duì)標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個(gè)粗略的估計(jì)。例如 HBsAg檢測(cè)的陰 性對(duì)照品中不可含 HBsAg，最好抗 HBs也是陰性。由于大量正常人血甭較難得到，國(guó)外試劑盒中的對(duì)照品多以復(fù)鈣人血漿 (recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似。 陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品 陽(yáng)性對(duì)照品 (positive control)和陰性對(duì)照品 (negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照，因此對(duì)照品，特別是陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致。 洗滌液 在板式 ELISA中，常用的稀釋液為含 %吐溫 20 磷酸緩沖鹽水。用 NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。 AP的底物 AP為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯 (pnitrophenyl phosphate,pNPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。 H2O2 應(yīng)用最多，但尿素過(guò)氧化物為固體，作為試劑較 H2O2 方便、穩(wěn)定。用于 ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測(cè)定的線性范圍。 ABTS雖不如 OPD和 TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。另外， TMB又有無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在E