【正文】 這種評價方式有一定缺點，即各實驗室常對質(zhì)控物特殊對待，在檢驗時選用特殊試劑盒，選派特別的技術員進行檢驗，有的實驗室互相和對結果并作修改。部臨檢中心經(jīng)統(tǒng)計分析，將評價結果寄回各實驗室。 發(fā)質(zhì)控物進行調(diào)查這是國內(nèi)外室間質(zhì)評的常用形式。室內(nèi)質(zhì)控主要監(jiān)測試驗結果的精密度，而室間質(zhì)評主要控制試驗結果的準確度，不能互相替代。各實驗室試驗結果報到質(zhì)控中心，經(jīng)過統(tǒng)計分析，得出相互比較的結果。將前20次的數(shù)值求出的和SD作質(zhì)控框架圖，第21次的數(shù)值，依次點入即可。即刻性質(zhì)控統(tǒng)計方法，適于ELISA測定的質(zhì)控。數(shù)值處于告警和失控狀態(tài)應舍去，重新測定該項質(zhì)控血清和病人樣本。4)將SDI上限、SDI下限值與SDI值中的數(shù)字比較。即刻法的建立具體計算方法如下：1)先將測定值從小到大排列2)計算X和SD。有些實驗室不是每天進行ELISA項目的檢驗，而ELSIA試劑盒效期短，用一批號試劑盒連續(xù)常規(guī)測20次，難度較大。第③、④種情況，單獨依靠記錄往往是不易察覺的，但在質(zhì)控圖上可以清晰地發(fā)現(xiàn)這種失控。如果OCV檢驗的結果仍是好的，說明常規(guī)操作出現(xiàn)問題。更換試劑盒或更換質(zhì)控血清，找出原因糾正后重新檢驗。每批測定放一份質(zhì)控血清時，一次超過2SD應作為告警，二次超出2SD為失控。ELISA試驗中，各種檢驗項目的誤差允許范圍均有待在實踐中得出結論，以上只是舉例說明質(zhì)控方法，不是定論。利用質(zhì)控圖可以對每次檢驗的結果進行監(jiān)測，當沒有更換另一批號試劑盒和另一批號質(zhì)控血清時，該質(zhì)控圖可以連續(xù)作下去。在此不再舉例說明。,未知值質(zhì)控血清變異(routine conditions varianclunknown value 簡稱RCVU)的測定有時為了避免主觀性,再作RCVU測定。通過質(zhì)控控制各項條件，使RCVK的數(shù)據(jù)盡可能接近OCV值。如果RCVK的SD值更小，說明OCV不是最佳條件下測定的，應重新再測OCV。若太大應該查找原因，使其向OCV的SD值靠近。做常規(guī)檢驗的技術人員，在常規(guī)檢驗的條件下，將質(zhì)控血清放在常規(guī)檢測樣本中，進行20次檢驗，結果計算同OCV法。從這20個數(shù)據(jù)中，求出OCV的X和SD。并作雙份測定，得出2個吸光值（A值），求出X。在該實驗室中選擇素質(zhì)最好、操作最熟練的技術員進行認真地專門測定，選用最佳的試劑盒，檢測之前，將恒箱、加樣器等認真校正、調(diào)校正、調(diào)試，使用新的加樣吸頭等，即在最佳、最理想的條件下進行檢測?，F(xiàn)舉例說明HBsAg ELISA法檢測時OCV的測定。相反，如果將允許誤差定得過大，將使監(jiān)測系統(tǒng)察覺不到臨床上要求檢出的誤差，失去質(zhì)控的意義。對任何一個試驗都應確定一個允許的誤差范圍，前題是滿足臨床要求。3） 未知值的血清在常規(guī)檢驗條件下的誤差。1） 最佳條件下的測定誤差。 室內(nèi)質(zhì)量控制程序臨床檢驗的檢測結果，每次或每天之間不可能沒有誤差。2030次測定結果刪除177。如果該試驗還有其它要　　求，則應加所要求濃度的質(zhì)控物。不可反復凍融。5） 抽濾除菌。4） 用10%的小牛血清或正常人血清（PBS緩沖液）將收集的血清稀釋至所需的濃度。2） 56℃加熱10小時來活。 質(zhì)控血清的制備每個實驗室可以根據(jù)自己的條件，選用臨床中心提供的質(zhì)控血清，或按以下方法自己制備本室使用的質(zhì)控血清（以乙肝質(zhì)控血清為例）。乙肝標志物臨界值的制定，應按臨床要求，為臨床提供統(tǒng)一的判斷弱陽性的標準。 臨界值質(zhì)控血清質(zhì)控制血清分定值和未定值兩種。自制的不定值質(zhì)控血清，在一批質(zhì)控血清將用完之前，需準備下一批質(zhì)控血清。不宜反復冰融或自行分裝。 質(zhì)控血清的使用衛(wèi)生部臨床檢驗中心制備的乙肝標志物質(zhì)控血清，可以在20℃保持半年定值不變。如果出現(xiàn)超過允許誤差范圍的異常結果，提示該檢驗不合格，應尋找原因，糾正后，重檢待測標本。質(zhì)控血清是已有靶值的血清，在每次的常規(guī)檢驗中加入一份或數(shù)份，通過所得結果來了解本次檢驗的情況。 臨床決定性水平（clinical decision leuel）當某個被測物的濃度達到某一水平時，臨床醫(yī)師必須采用醫(yī)療措施。參考標準血清 國家標準化組織根據(jù)國際標準化生產(chǎn)的法定材料。 標準品國際標準品 由WHO或相應組織標定的，用肯定的、公認的、準確的物理或化學方法測定的定值材料。　　絕對偏差=檢驗的均值真值（或靶值）　　相對偏差=絕對偏差真值247。準確度不能以數(shù)字表示，往往用不準確度來衡量。通過可靠的決定性方法測出的值，稱為靶值，通常用靶值來表示真值的大小。 真值用確切的、最理想的決定性方法測得的值，稱為真值。當我們要求檢驗結果在X177。2SD范圍內(nèi)分布的數(shù)據(jù)占總體的95%，在X177。換言之，當ELSIA檢測同一樣本達一定次數(shù)后所得的一組數(shù)據(jù)，其中靠近均值（X）的177。2SD，　　　　X177。正態(tài)曲線以下的面積稱概率，常用樣本的均數(shù)（X）和標準差（SD）來表示，其計算方法如下：　　　　均值、標準差和概率的關系如下：　　X177。如果以測定值為橫坐標，以出現(xiàn)的頻率為縱坐標作圖，就可繪出一個呈鐘形的曲線圖。通過加強實驗室管理和開展質(zhì)量控制工作是可以避免的。檢驗工作中隨機誤差的分布符合正態(tài)分布規(guī)律。系統(tǒng)誤差是指一系列測定結果與真值或靶值存在有同一傾向的誤差，有明顯的規(guī)律性，可在一定條件下重復出現(xiàn)，是可以通過質(zhì)控預防和校正的?？刂葡奘峭ㄟ^統(tǒng)計計算出來的，在后我們將詳細介紹（）。這種性能數(shù)據(jù)是在按規(guī)程正常進行時，按時間順序而抽選出來的，其目的是檢測檢驗過程中變異的可追查性原因。質(zhì)量控制主要采用質(zhì)控圖進行。　　5）采取行動，解決差異。　　1）確定控制的對象；　　2）規(guī)定控制對象的標準（預期值）；　　3）制定或選擇控制方法和手段；　　3）測量實際數(shù)據(jù)；　　4）比較或較對實際數(shù)據(jù)與預期值之間的差異，并說明產(chǎn)生這一差異的原因。 基本概念 質(zhì)量控制（Quaility Control,）質(zhì)量控制是監(jiān)視全過程，排除誤差，防止變化，維持標準化現(xiàn)狀的一個管理過程。因為ELISA是目前臨床上最常用的一種免疫學檢驗方法，就以ELISA檢驗為例，介紹一下有關問題。統(tǒng)計學的實驗室室內(nèi)質(zhì)控是全面質(zhì)量管理中的一個重要環(huán)節(jié)。全面質(zhì)量管理的宗旨在于預防差錯的產(chǎn)生。到70年代，實驗室質(zhì)量控制進入一個新的階段全面質(zhì)量管理，推行Good Laboratory Parctice（簡稱GLP）。ELISA測定的標準曲線示例見圖42。測定小分子量物質(zhì)常用競爭法（），其標準曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負相關。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標準曲線的范圍一般較寬，繪制時常用半對數(shù)紙，以檢測物的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區(qū)域。b. 抑制率法抑制率表示標本在競爭結合中標本對陰性反應顯色的抑制程度，按下式計算：抑制率（%）= （陰性對照A值標本A值）100%/陰性對照A值一般規(guī)定抑制率≥50%為陽性，＜50%為陰性。而且應≥NCX并≤NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另2個陰性對照重新計算NCX；如有2個陰性對照A超出以上范圍，則該次實驗無效。每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復鈣人血漿，陽性對照中抗HBc含量為125177。計算方法主要也有兩種，即陽性判定值法和抑制率法。陰性呈色的強度取決于反應中酶結合物的濃度和加入競爭抑制物的量，此時反應最為敏感。因此，這類試劑盒規(guī)，如N（或其他數(shù)值），否則將出現(xiàn)假陽性結果。更應注意的是，N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽性標準，現(xiàn)多為各種測定所沿用。也有寫作P/N的，這里的P不代表陽性(positive)，而是病人（patient）的縮寫，不應誤解。在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。應注意的是，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。3個陰性對照A值均應≥NCX，并≤NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個陰性對照重新計算NCX；如有兩個陰性對照A值超出以上范圍，則該次實驗無效。每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復鈣人血漿，陽性對照品HBsAg的含量標明為P=9177。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標本的實驗檢測而得到的。a． 陽性判定值陽性判定值（cutoff value）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù)，以此作為判斷結果陽性或陰性的標準。先讀出標本（sample，S）、陽性對照（P）、和陰性對照（N）的吸光值，然后進行計算。目視法簡捷明了，但頗具主觀性。陰性對照的組成應為不含受檢物的正常血清或類似物（）。目視標本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。兩類反應的結果判斷方法不同，分述于下。在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。陰性則為無反應。 結果判斷 定性測定定性測定的結果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出有或無的簡單回答，分別用陽性、陰性表示。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的位置。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器1530分鐘，測讀結果更穩(wěn)定。超出可測上限的A值常以*或over或其它符號表示。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同。(~），重復測定數(shù)次，177。1%，%。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。最好在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。 比色比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（1224小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當縮短或延長反應時間，及時判斷。適當提高溫度有助于加速顯色進行。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。洗滌時設法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。（2）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。吸干應徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；，洗滌34次（或按說明規(guī)定）?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。 洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標準室溫溫度是指2025℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結合的合適溫度。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。 保溫在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。每次加標本應更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。自配的緩沖液應用pH計測量較正。 試劑的準備按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。凍結血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。血清標本宜在新鮮時檢測。在ELISA中血漿和血清可同等應用。制備血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。大部分ELISA檢測均以血清為標本。 標本的采取和保存可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均