【正文】 (5)干燥處理：用空氣干燥、真空干燥、冷凍以及脫水干燥法干燥、懸浮、抽提。如空氣干燥，一般在 25—30 ℃ 或高到35—40℃ 的氣流中吹干，然后將干菌體懸浮于 3—5倍的水中或緩沖液中，室溫?cái)嚢?2—3h抽提。 酶破碎法 酶處理：作用于細(xì)胞壁的酶有白細(xì)胞酶、溶菌酶等，用以處理細(xì)胞，使酶釋放出來(lái)。溶菌酶專一性地分解菌體細(xì)胞壁上多糖分子的 β—1， 4—糖苷鍵，從而破壞細(xì)胞壁 . 抽提 抽提溶劑：稀鹽、稀酸或稀堿的水溶液（大多數(shù)酶蛋白屬于球蛋白）。 抽提液的具體組成和抽提條件的選擇，取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性，還要有利于切斷酶與其他物質(zhì)的連結(jié)。 抽提液 pH：首先，選用 pH不應(yīng)超過酶的 PH穩(wěn)定范圍；其次，應(yīng)遠(yuǎn)離待抽提酶的等電點(diǎn)（酸性蛋白宜用堿性溶液抽提；堿性蛋白宜用酸性溶液抽提。在某些情況下，抽提還兼有切斷酶與細(xì)胞內(nèi)其它成分間聯(lián)結(jié)的作用，在不影響酶活性的前提下，可考慮酸堿性強(qiáng)一些，如在 pH46時(shí)抽提堿性蛋白效果很好。 抽提液鹽濃度：抽提液一般采用等滲溶液。最普通的為 —磷酸緩沖液 , 。焦磷酸鈉和檸檬酸鈉的緩沖液有助于切斷酶和其他物質(zhì)的聯(lián)系 ,也常用。（有時(shí)用水抽提亦佳 , 低滲還可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。） 抽提溫度：溫度通?？刂圃?04℃ 左右 .如果酶比較穩(wěn)定時(shí)，可以例外。如胃蛋白酶可在 37℃ 保溫抽提。 抽提液用量：常采用原料量的 1—5倍。有時(shí)為提高抽提效果可反復(fù)抽提或加大抽提液用量。 其他：如加入蛋白酶抑制劑 ,以防止蛋白酶（亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞溶出）破壞目的酶；為防止氧化，加入 Cys或維生素 C、惰性蛋白及底物等。 結(jié)合酶抽提 （ 1）和顆粒結(jié)合不太緊的結(jié)和酶，在顆粒結(jié)構(gòu)受損傷時(shí)，抽提也不難。例如： α— 酮戊二酸脫氫酶、延胡索酸酶，可用緩沖液抽提出來(lái)； CytC可用 0． 145mol/L的三氯乙酸溶液抽提出來(lái)。 （ 2）和顆粒結(jié)合緊密的酶，常以脂蛋白絡(luò)合物形式存在，有的做成丙酮粉以后，就可以抽提出；有的要使用正丁醇等強(qiáng)烈手段處理（正丁醇兼有高度的親脂性和親水性 特別是磷酸鹽 ，能破壞蛋白間的結(jié)合使酶進(jìn)入溶液，如琥珀酸脫氫酶）；近年來(lái)，廣泛采用表面活性劑，如膽脂酸鹽、 Triton、 Tween、 Teepol、十二 烷基磺酸鈉等，抽提呼吸鏈酶系（如鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶的抽提，向菌體懸浮液中加入 0． 1％十二烷基吡啶氯化銨．酶的抽出率提高到 8倍；有時(shí)使用促溶劑如高氯酸；有時(shí)還用酶處理，如脂肪酶、核酸酶、蛋白酶等。 表面活性劑對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶抽提效果的影晌 濃縮 提取液或發(fā)酵液的酶蛋白濃度一般很低，如發(fā)酵液中酶蛋白濃度一般為 ％一 1％。因此，在分離純化過程中，酶溶液往往需要濃縮。濃縮的方法很多，如：鹽析或溶劑沉淀法、超過濾法、離子交換樹脂法等。這些方法既是濃縮的方法，又是分離純化的手段．再如真空濃縮、冷凍濃縮法、蒸發(fā)法、凝膠吸水法、聚乙二醇吸水法等。 冷凍干燥法 將酶溶液凍成固體后抽真空，使水分子直接從表面升華，最后酶呈干粉狀。采用這種方法能使多種酶活性長(zhǎng)期保存。但操作需注意幾個(gè)問題：首先被凍的最好是酶的水溶液。如果混有有機(jī)溶劑，會(huì)降低水的冰點(diǎn)，在干燥時(shí)．樣品融化而起泡導(dǎo)致酶變性，同時(shí)，會(huì)使真空泵失效。其次，如果混有磷酸鹽，在冷凍干燥時(shí)會(huì)引起 pH的變化，例如： PH 7的磷酸鹽在冷凍時(shí)由于磷酸二氫鈉會(huì)結(jié)晶析出，在溶液完全冷凍以前， pH便變成 左右。因此，在冷凍前，需將酶溶液脫鹽。 依據(jù)溶液相對(duì)純水熔點(diǎn)升高，冰點(diǎn)下降原理，對(duì)少量樣品，一是將溶液凍成冰，然后緩慢溶解，這樣冰塊 (不含酶 )就浮于表面，酶溶解并集中于下層溶液 (約為原體積的 1/4)；二是讓酶溶液慢慢凍結(jié)后移去水結(jié)成的冰。這種方法也會(huì)發(fā)生離于強(qiáng)度和 pH的變化。 蒸發(fā)法 通常采用的減壓蒸發(fā)法和實(shí)驗(yàn)室常用的超蒸發(fā)法，都因效率低、費(fèi)時(shí)等在工業(yè)上很少應(yīng)用。目前，工業(yè)上應(yīng)用較多的是薄膜蒸發(fā)法。薄膜蒸發(fā)法，即將待濃縮的酶溶液在高度真空下轉(zhuǎn)變成極薄的液膜，液膜通過加熱而急速汽化，經(jīng)旋風(fēng)汽液分離器，將蒸汽分離、冷凝而達(dá)到濃縮目的。薄膜蒸發(fā)器有：升膜式、降膜式、刮膜式、離心式等多種。根據(jù)物料不同而加以選擇。 超過濾 超過濾是在加壓的條件下，將酶溶液通過一層只允許小分子物質(zhì)選擇透過微孔半透膜．而酶等大分子物質(zhì)被截留，從而達(dá)到濃縮的目的。如果采用不同孔徑的膜，同時(shí)又具有分級(jí)分離的作用。這種方法具有下列優(yōu)點(diǎn)：不需加熱，更適用于熱敏物濃縮；無(wú)相變化、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便；能在廣泛的 pH條件下操作等，因此，近年來(lái)發(fā)展很快。超濾膜主要有以下幾種類型： (1)平面膜 將膜平鋪在多孔支持板上，加壓下 (可帶有攪拌 )酶溶液從膜面流過水及小分子溶質(zhì)透過膜孔而排比，大分子 (如酶 )被截留。 (2)管式膜 將管式膜置于多孔硬管的外側(cè)或內(nèi)側(cè)，酶溶液在管內(nèi)或管外流動(dòng)，水和分子溶質(zhì)透過越濾膜，而大分子物質(zhì)被截留而濃縮。 (3)中空纖維 將聚砜作成中空纖維膜，成束中空纖維裝在圓筒真空超濾器中 . 膠過濾 利用 Sephadex G250或 G— 50等吸嘆水膨脹，酶被排阻在膠外面的原理而進(jìn)行濃縮。 其他 如利用聚乙二醇等濃縮，只適用于小量樣品。 (2)管式膜 將管式膜置于多孔硬管的外側(cè)或內(nèi)側(cè)，酶溶液在管內(nèi)或管外流動(dòng)，水和分子溶質(zhì)透過越濾膜，而大分子物質(zhì)被截留而濃縮。 (3)中空纖維 將聚砜作成中空纖維膜，成束中空纖維裝在圓筒真空超濾器中 . 膠過濾 利用 Sephadex G250或 G— 50等吸嘆水膨脹，酶被排阻在膠外面的原理而進(jìn)行濃縮。 其他 如利用聚乙二醇等濃縮，只適用于小量樣品。 將酶從溶液中分離純化出來(lái)的方法 大分子物質(zhì)：核酸；粘多糖、雜蛋白等 小分子物質(zhì) 除去核酸及其相關(guān)蛋白： 硫酸魚精蛋白、硫酸鏈霉素、聚乙烯亞胺、三甲基氨十六烷基溴及 MnCl2預(yù)先沉淀，離心除去、必要時(shí)，可用核酸酶。根據(jù)不同材料選擇不同的試劑。 除去粘多糖： 常用醋酸鉛、乙醇、單寧酸及離子型表面活性刑等處理除去，有時(shí)也用酶除去。 除去雜蛋白： 除去雜蛋白 酶和雜蛋白的性質(zhì)差異大體上可有以下幾個(gè)方面，根據(jù)這些差異 .其分離方法可有： (1)根據(jù)分子大小輕重設(shè)計(jì)的方法。如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過濾法等。 (2)根據(jù)溶解度大小分離的方法、如鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。 (3)按分子所帶正負(fù)電荷多少分離的方法，如離子交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等。 (4)按穩(wěn)定性差異建立的分離方法，如選擇性熱變性法表面變性法等。 (5)按親和作用的差異建立的分離方法，如親和層析法等 . 酶活力 酶活力 ： 酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱酶活力 ， 酶活力通常以最適條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度來(lái)確定 。 轉(zhuǎn)換系數(shù) ： 轉(zhuǎn)化底物的分子數(shù) / 秒 每個(gè)酶分子 活力單位 （ active unit） 習(xí)慣單位 （ U） : 底物 (或產(chǎn)物 )變化量 / 單位時(shí)間 國(guó)際單位 （ IU） : 1μmoL變化量 / 分鐘 Katal（ Kat） ： 1moL變化量 / 秒 比活力 = 總活力單位 總蛋白 mg數(shù) = U(或 IU) mg酶蛋白 量度酶催化能力大小 量度酶的純度 比活力 （ specific activity） 對(duì) 液體 酶：用 活力單位 /ml酶液 來(lái)表示。 酶活力及酶量的表示方法 終點(diǎn)法 : 酶反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后終止其反應(yīng) ， 再用化學(xué)或物理方法測(cè)定產(chǎn)物或反應(yīng)物量的變化 。 動(dòng)力學(xué)法 :連續(xù)測(cè)定反應(yīng)過程中產(chǎn)物\底物或輔酶的變化量 ， 直接測(cè)定出酶反應(yīng)的初速度 。 酶活力測(cè)定方法：終點(diǎn)法 動(dòng)力學(xué)法