【正文】 128 舉例 ——標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn) 1. 打開 ATi 動態(tài)試管分析儀電源開關(guān)，預(yù)熱 ； 2. 連接 ATi 試管儀與計(jì)算機(jī)，運(yùn)行 “ BioProbe2022細(xì)菌內(nèi)毒素測定系統(tǒng) ” ； 3. 選擇測定方法，如：動態(tài)法 ； 4. 確定工作波長，如： 405nm； 5. 選擇自動停止時間，如： 3600秒 ； 6. 填寫檢驗(yàn)表頭，包括檢驗(yàn)員姓名、 TAL的批號、 內(nèi)毒素 的批號、BET水的批號、室溫等 ； 7. 填寫檢驗(yàn)表格，包括陰性對照、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列等 ； 8. 檢查各選項(xiàng)的選擇及表格填寫無誤后，用鼠標(biāo)點(diǎn)擊 [開始采集 ]按鈕，使系統(tǒng)進(jìn)入 “ 數(shù)據(jù)采集 ” 狀態(tài) ； ☆ 步驟 57 也可在步驟 8 之后進(jìn)行 Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 129 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 130 舉例 ——標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn) 制備標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液 、 、 30s 30s 15min 9000EU/ml RSE BET水 900EU/ml 90EU/ml 9EU/ml 30s 30s 30s Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 131 舉例 ——標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn) 細(xì)菌內(nèi)毒素的每一步稀釋都必須在 旋渦混合器 上振蕩混合 Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 132 舉例 ——標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn) TAL的準(zhǔn)備 ① 取動態(tài)濁度法 TAL1支，用砂輪在 安瓿頸 劃痕，擦拭后，折斷之（避免玻璃屑落入安瓿內(nèi)）； ② 用刻度吸管或移液器準(zhǔn)確吸取 BET水 TAL的安瓿內(nèi)，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物全部溶解（避免產(chǎn)生氣泡）； ③ 取試管架一個，按 EU/ml、 EU/ml、 、 NC順序用記號筆作標(biāo)記后插入專用反應(yīng)試管，各內(nèi)毒素濃度分別平行 3管， NC平行 3管； ④ 用刻度吸管或移液器準(zhǔn)確吸取TAL溶液分配到每支反應(yīng)試管中。 Aamp。C 133 舉例 ——標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn) 加樣： TAL＋ RSE，平行三管，混勻 TAL RSE NC BET水 Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 134 135 舉例 ——標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn) 1. 試管一插入，就不得再碰觸或轉(zhuǎn)動； 2. 內(nèi)毒素與鱟試劑混合后應(yīng)盡快插到試管儀中進(jìn)行反應(yīng)。 注 Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 136 供試品干擾試驗(yàn) 選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一個內(nèi)毒素濃度 ， 按下表制備溶液 A、 B、 C、 D 溶 液 內(nèi)毒素濃度 加入內(nèi)毒素的溶 液 平行管數(shù) A 無 供試品溶液 3 B 標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)濃度（或附近的點(diǎn)） 供試品溶液 3 C 至少 3個濃度（最低一點(diǎn)設(shè)定為 λ） 檢查用水 每一濃度 3個 D 無 檢查用水 2 Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 137 供試品干擾試驗(yàn) 溶液 A：稀釋倍數(shù)未超過 MVD的供試品溶液； 溶液 B：含有標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)（ λm）或靠近中點(diǎn) 濃度內(nèi)毒素的，和溶液 A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液； 溶液 C：用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液； 溶液 D：檢查用水（陰性對照） Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 138 供試品干擾試驗(yàn) MVD的計(jì)算 MVD=L/ λ1 ☆ λ1為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)濃度 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 139 ○○ 陰性對照 鱟試劑 +λ 鱟試劑 +λm 鱟試劑 +λ最高 ○○○ 鱟試劑 +D ○○○ ○○○ 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 鱟試劑 +B ○○○ 測定含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量 （ Cs） 鱟試劑 +A ○○○ 測定供試品內(nèi)毒素含量 （ Ct） 供試品干擾試驗(yàn) Aamp。C NPC PPC 標(biāo)準(zhǔn)曲線 NC 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 140 供試品干擾試驗(yàn) 按所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量 Ct和 Cs， 再按下式計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率 （ R） %100??? m CtCsR ?）回收率（結(jié)果判斷 ： ? 標(biāo)準(zhǔn)曲線： |r|≥ ， 有效； ? 陰性小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度 λ1， 有效； ? 回收率 （ R） 50%～ 200%， 無干擾 。 Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 141 舉例 —諾氟沙星葡萄糖注射液 干擾試驗(yàn) 試劑名稱 廠家 批號 裝量 規(guī)格 數(shù)量 動態(tài)濁度 TAL 安度斯 0308120 ~RSE 中檢所 981 9000EU/支 1 BET水 安度斯 0306240 25ml/瓶 ＜ 諾氟沙星葡萄糖注射液 *** 0203123 100ml/瓶 100ml： 氟沙星， 5g葡萄糖 1 *** 0205230 100ml/瓶 1 *** 0207191 100ml/瓶 1 Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 142 舉例 —諾氟沙星葡萄糖注射液 干擾試驗(yàn) 1. 根據(jù)初篩試驗(yàn)，選擇鱟試劑靈敏度及樣品檢測濃度： a. 濁度 TAL的檢測靈敏度范圍 10EU/ml~ 的有效濃度為 S20（稀釋 20倍） Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 143 舉例 —諾氟沙星葡萄糖注射液 干擾試驗(yàn) 諾氟沙星葡萄糖注射液 30s S ml BET水 S10 A液： S20 ml ml ml 30s 2. 制備反應(yīng)溶液 a. 溶液 A：供試品 20倍稀釋液 Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 144 舉例 —諾氟沙星葡萄糖注射液 干擾試驗(yàn) b. 溶液 C： 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液 BET水 9000EU/ml RSE E90 E9 E3 E900 Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 145 S10 旋渦震蕩 舉例 —諾氟沙星葡萄糖注射液 干擾試驗(yàn) C. 溶液 B： 含有標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn) （ λm） 內(nèi)毒素濃度的 ， 和溶液A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液 Aamp。C 30S 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 146 舉例 —諾氟沙星葡萄糖注射液 干擾試驗(yàn) 3. 加樣 ○ ○ ○ + ○ ○ ○ TAL+ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ TAL+ TAL+ TAL+ ○ ○ TAL+ Aamp。C NPC PPC NC 標(biāo)準(zhǔn)曲線 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 147 供試品日常檢查 1. 根據(jù)干擾試驗(yàn)，選擇 TAL的靈敏度和供試品 的有效稀釋倍數(shù)（ ≤ MVD）或有效濃度（ ≥ MVC） ； 2. 制備 ： ① 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 系列（ C）：用 BET水稀釋的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液 ② A：供試品稀釋液（ NPC） ③ B：含中點(diǎn)內(nèi)毒素 λ m的供試品稀釋液 （ PPC） 3. 反應(yīng)： ① 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線： TAL＋ C，至少三個濃度，平行二管 ②供試品陽性管（ PPC） ： TAL＋ B，平行二管 ③供試品管（ NPC） ： TAL+A，平行二管 ④陰性管（ NC） ： TAL+BET水，平行二管 Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 148 測定供試品內(nèi)毒素含量（ NPC） ○ ○ 鱟試劑 +A 測定含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素λm的供試品溶液的內(nèi)毒素含量（ PPC） ○ ○ 鱟試劑 +B 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 ○ ○ ○ ○ ○ ○ 鱟試劑 +λ最高 鱟試劑 +λm 鱟試劑 +λ 陰性對照（ NC） ○ ○ 鱟試劑 +BET水 Aamp。C 供試品日常檢查 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 149 供試品日常檢查 結(jié)果判斷： ● 標(biāo)準(zhǔn)曲線： |r|≥ ，有效； ● NC：全部 ＜ 最低濃度 λ1，有效； ● PPC：回收率 50%～ 200%，有效； ● NPC：全部 ＜ L（內(nèi)毒素限值），合格； 全部 ≥ L，不合格； 兩支中有一支 ≥ L，復(fù)測。 Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 150 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 151 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 152 ?定量法的最大優(yōu)勢是快捷、定量，在生產(chǎn)質(zhì)控中可迅速對生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的原料、半成品、輔劑等作有效的檢查； ?定量檢測可以提供很高的檢查靈敏度，動態(tài)顯色法可檢出 ，這是其它方法做不到的。 Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 153 舉例：定量法應(yīng)用（二） ?確定供試品的無干擾濃度（日常檢測濃度）； ?制備該濃度下無可測內(nèi)毒素供試品的含 L值內(nèi)毒素溶液； ?在定量檢測儀上進(jìn)行內(nèi)毒素的檢測 Aamp。C 生產(chǎn)質(zhì)控中內(nèi)毒素的檢測 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 154 舉例 —生產(chǎn)質(zhì)控中內(nèi)毒素的檢測 例如：某供試品在 20倍下無干擾 S10 E2L S20EL 旋渦震蕩 ☆ L為供試品控制的內(nèi)毒素限值 Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 155 舉例 —生產(chǎn)質(zhì)控中內(nèi)毒素的檢測 預(yù)設(shè)透光度值 S20EL 產(chǎn)品 不 合格 產(chǎn)品合格 T1 T T2 Aamp。C S20 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 156 樣品原液內(nèi)毒素含量 調(diào)用的標(biāo)準(zhǔn)曲線 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 157 80% ＜ 25% 生產(chǎn)質(zhì)控 鱟試劑應(yīng)用的比較 20% 3% 27% 25% 45% 美國 ＞ 75% — — — — — — ＞ 95% 中國 終產(chǎn)品檢驗(yàn) 終點(diǎn)顯色 動態(tài)顯色 動態(tài)濁度 凝膠法 檢驗(yàn)方法的比較 “定量”是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查發(fā)展的趨勢 Aamp。C 江蘇省蘇州藥品檢驗(yàn)所 158 ? ? 結(jié)束！謝謝大家！