【正文】 BK ][][ ][ ?? ??? ｋ＇nsaqABmsA VVBEVVK ????? ? ][ 討論： a) 增加反離子濃度 [B]aq↑ ｋ＇↑，保留時(shí)間↑； b) AB 易被有機(jī)相萃取 EAB↑ ｋ＇↑，保留時(shí)間↑ 水 水 水 AB AB B B B A+ A+ 離子對(duì)色譜分離過(guò)程示意圖 AB AB AB 固定相 流動(dòng)相 固定相 正相 反相 流動(dòng)相 固定相 然而，無(wú)論在正相還是反相離子對(duì)色譜中。當(dāng) [B]aq 增大到一定濃度時(shí)，樣品離子基本上都已轉(zhuǎn)化成離子對(duì) AB（不可能 100%轉(zhuǎn)化），于是ｋ＇基本保持不變。為了使ｋ＇有合適的數(shù)值，即保持ｋ＇在 1~10 之間，關(guān)鍵是選擇合適的反離子種類和濃度。ｋ＇太大，分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；ｋ＇太小，則分離不開(kāi)。 離子對(duì)色譜保留機(jī)理的解釋尚有爭(zhēng)論，上述假設(shè)只是一種離子對(duì)模式，除此之外還有動(dòng)力學(xué)離子交換模式和離子相互作用機(jī)理。 二、基本方法 1. 正相離子對(duì)色譜 采用硅膠、硅藻土或纖維素為擔(dān)體，合適 pH 的以 一定濃度溶于水或緩沖液的反離子涂于擔(dān)體上。流動(dòng)相為弱極性的與水不相容有機(jī)溶劑（如氯仿，二氯甲烷等）。有時(shí)加入 5~10%的親脂性醇改善峰形。樣品溶于有機(jī)溶劑或含有反離子的意有機(jī)溶劑后進(jìn)樣。（ A+B）離子對(duì)存在于流動(dòng)相中，可通過(guò)不同的反離子改善檢測(cè)。如使用萘 乙 磺酸或苦味酸（OHNO2O2NNO2）為反離子時(shí)，能使沒(méi)有紫外吸收的物質(zhì)也能被檢測(cè)。 正相離子對(duì)色譜中的反離子是加在固定相中的。色譜過(guò)程中要消耗反離子而使色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定，所以在應(yīng)用上受到限制。 2. 反相離子對(duì)色譜 固定相為 化學(xué)鍵合相的非極性表面，尤以 ODS（ C18）及 C8 反相柱最適宜，流動(dòng)相同 RPHPLC 一樣，常用甲醇 水，乙腈 水。反相離子對(duì)色譜系統(tǒng)穩(wěn)定，且不存在固定液流失問(wèn)題。ｋ＇的調(diào)節(jié)也很方便，可隨時(shí)改變反離子濃度及 pH 等。此外，還適宜于梯度洗脫。所以反相離子對(duì)色譜乙獲得廣泛的應(yīng)用。 三、影響分離的因素 1. pH 的影響 合適的 pH 是離子對(duì)色譜的重要條件，它將決定離子型化合物的解離度，為了有最大的保留和響應(yīng)，希望有最大的解離，但又不能超出柱子所能承受的范圍，一般 pH 為2~，最多不超過(guò) 9。 分離強(qiáng)酸性藥物， pH 低也 能充分解離，故對(duì) pH 要求不嚴(yán)；對(duì)于弱酸性藥物，如磺胺類，巴比妥類藥物等，需在 pH 高時(shí)才能充分解離，若 pH 低，含抑制解離，樣品組分呈不解離溶質(zhì)，則按一般色譜進(jìn)行。堿性試樣的分析可控制在較低 pH，能在柱適應(yīng)范圍內(nèi)較方便地進(jìn)行。 樣品類型 pH值范圍 備注 強(qiáng)酸型（ pKa2)，如磺酸化染料 2～ 均解離，離子對(duì)色譜法分析 弱酸性（ pKa2)，如氨基酸、羧酸 6～ 解離，離子對(duì)色譜法 2～ 5 解離受到抑制，離子抑制法 樣品類型 pH值范圍 備注 強(qiáng)堿型（ pKa8)，如季銨類藥 物 2～ 8 均解離，離子對(duì)色譜法分析 弱堿性（ pKa8)，如兒茶酚胺 6～ 解離受到抑制，離子抑制法 2～ 5 均解離，離子對(duì)法 2. 不同反離子（ B）對(duì)離子對(duì)提取常數(shù)（ EAB）和ｋ＇的影響 不同的反離子所形成的離子對(duì)的提取常數(shù)是不同的，因此ｋ＇也不同。一般來(lái)講，在正相 IPC 中，反離子的非極性部分越大（如季胺離子的烷基越大），則提取常數(shù)越大，ｋ＇就越小；而反相 IPC 中，反離子的非極性部分越大，ｋ＇也越大。 3. 改變流動(dòng)相的種類和性質(zhì)是提高分離選擇性的重要途徑 流動(dòng)相中采用不同的有機(jī)溶劑 ，則 EAB 不同。 鹽酸腎上腺素 (Adrenaline。 Epinephrine) ChP: 填充劑： ODS； 流動(dòng)相： ％庚烷磺酸鈉溶液－甲 醇（ 65:35），用磷酸調(diào)節(jié) pH值至 177。 ； 檢測(cè)波長(zhǎng) :280nm。 理論板數(shù)應(yīng)不低于 3000。 鹽酸嗎啡 磷酸可待因 色譜柱：μ－ BondapakC18 流動(dòng)相：甲醇 水（含有 磺酸鈉， pH＝ ）＝ 41： 59 、 聯(lián)邦止咳露 通用名是 “ 復(fù)方磷酸可待因溶液 ” ，其有效成分為：每 1ml含磷酸可待因 1mg，鹽酸麻黃堿 ，馬來(lái)酸氯苯那敏 22mg。 輔料：色素、防腐劑、矯味劑 色譜條件： 色譜柱 : Spherisorb C18； 10μm, 179。250mm ； 流動(dòng)相 :甲醇 水 冰醋酸 己烷磺酸鈉 (30∶ 66∶ 2∶ 2)； 流速 : ； 檢測(cè)波長(zhǎng) :256 nm 。 溶液配制 ： 供試品溶液的配制：精密量取聯(lián)邦止咳露 3 ml ,置 10 ml 量瓶中 ,加醇 3 ml ,加水稀釋至刻度 ,搖勻 ,即得供試品溶液。 對(duì)照品溶液的配制 :精密稱取磷酸可待因?qū)φ掌?150 mg 和鹽酸麻黃堿 120 mg ,置同一個(gè) 50 ml量瓶中 ,加甲醇使溶解并稀釋至刻度 ,搖勻 ,即為貯備液。精密量取貯備液 1 ml 置 10 ml 量瓶中 ,加甲醇 1 ml ,加水稀釋至刻度 ,搖勻 ,即得對(duì)照品溶液。 第五節(jié) 分子篩色譜法（體積排阻色譜法） 一、概述 溶質(zhì)與 固定相或流動(dòng)相無(wú)相互作用的分離方式。 主要依據(jù)分子尺寸大小的差異來(lái)進(jìn)行分離的方法，即固定相（多孔凝膠）能有效的進(jìn)行分子量大小的分離。 具有不同分子大小的樣品通過(guò)柱時(shí)，溶質(zhì)分子能夠被柱填料的孔徑分類。 分析樣品：多肽、蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子、高聚物 流動(dòng)相為有機(jī)溶劑：凝膠滲透色譜（ gel permeation chromatography， GPC）； 流動(dòng)相為水：凝膠過(guò)濾色譜（ gel filtration chromatography， GFC） 二、分離原理 大分 子：大分子不能進(jìn)入凝膠孔洞而被完全排除，只能沿著凝膠顆粒之間的空隙通過(guò)色譜柱，最先被流動(dòng)相洗脫出來(lái)。 小分子：小分子能進(jìn)入凝膠的絕大部分孔洞，在柱中收到更強(qiáng)的滯留，會(huì)更慢地被洗脫出來(lái)。 中等大小分子： 中等大小分子只能進(jìn)入凝膠中一些適當(dāng)?shù)目锥粗?，但不能進(jìn)入更小的微孔，所以在柱中受到的滯留作用介于大分子與小分子之間。 溶劑分子：溶解樣品的溶劑分子，分子量最小，可進(jìn)入凝膠的所有孔洞，最后從柱中流出。 洗脫體積 VR＝ Vm+Kd178。V s 溶質(zhì)分子能夠滲入填料內(nèi)孔體積的分?jǐn)?shù)： 當(dāng) VR＝ Vm， Kd＝ 0：說(shuō)明溶質(zhì)完全不進(jìn)入凝膠內(nèi)部，此現(xiàn)象稱為全排斥，此也為凝膠的排阻極限。 當(dāng) VR＝ Vm+Vs， Kd＝ 1：說(shuō)明溶質(zhì)完全進(jìn)入凝膠內(nèi)部，此現(xiàn)象稱為全滲透，此也為凝膠的滲透極限。 大部分溶質(zhì)： 0Kd1 優(yōu)點(diǎn)： 1）分離時(shí)間短，溶質(zhì)譜帶窄； 2）根據(jù)分子大小，可預(yù)測(cè)分離 3）分離過(guò)程中無(wú)樣品損耗和反應(yīng)發(fā)生； 4）柱幾乎不失活，壽命長(zhǎng)； 5）特別適用在未知樣品的探索分離。 三、固定相 smRd V VVK ??軟質(zhì)凝膠，不耐壓（中、低壓色譜）：葡聚糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 瓊脂糖凝膠 半硬質(zhì)凝膠 ：二乙烯基苯型凝膠 硬質(zhì)凝膠，耐壓：多孔玻璃凝膠 四、流動(dòng)相 1. 對(duì)樣品的溶解性好 2. 由于高分子量樣品的擴(kuò)散系數(shù)小，應(yīng)盡可能采用低粘度的溶劑 3. 與使用的凝膠固定相互相匹配 4. 與所使用的檢測(cè)器相匹配 五、色譜柱的標(biāo)定 目的：用以測(cè)定分子量及分子量分布 方法：用一系列已知分子量的標(biāo)樣制作標(biāo)定曲線。 舉例：中國(guó)藥典中測(cè)定多糖的分子量與分子量分布 1) 系統(tǒng)校正：根據(jù)供試品分子量的大小，選用 5個(gè)已知分子量的多糖標(biāo)準(zhǔn)品（如葡聚糖）作標(biāo)定曲線。 lgMw= a + b*tRMw：標(biāo)樣的已知重均分子 量 2）樣品測(cè)定 取供試品溶液，進(jìn)樣，根據(jù) tR帶入標(biāo)定曲線，即可求出多糖的每個(gè)組分相應(yīng)的分子量。 六、應(yīng)用舉例：頭孢曲松鈉中聚合物的檢查 第六節(jié) 高效液相色譜儀及其操作 第七節(jié) 液相色譜儀的基本操作 1．開(kāi)機(jī)前準(zhǔn)備工作：過(guò)濾流動(dòng)相；檢查儲(chǔ)液瓶中是否具有足夠的流動(dòng)相，吸液砂芯過(guò)濾器是否已插入儲(chǔ)液瓶底部；廢液瓶是否已倒空，所有排液管是否已妥善插在廢液瓶中。確定無(wú)誤后，可開(kāi)始操作。 2．開(kāi)啟穩(wěn)壓電源后，依次打開(kāi)輸液泵、柱溫箱、檢測(cè)器和色譜處理機(jī)電源。 3．在輸液泵及檢測(cè)器上設(shè)定所需要的流速、檢 測(cè)波長(zhǎng)等參數(shù)。 4．排出管路氣泡或沖洗管路：將排液閥旋轉(zhuǎn) 180176。至 open 位置，按 purge 鍵，輸液泵以 5 ml/min 流量輸液，觀察輸液泵中是否有氣泡排出，確定管路中無(wú)氣泡后，按 purge鍵，使輸液泵停止工作，再將排氣閥旋鈕旋轉(zhuǎn)至 close 位置。 5．按 pump 鍵，設(shè)定輸液泵以低流速（ ml/min）泵出流動(dòng)相，在此條件下接色譜柱，接好后再將流速設(shè)定為所需要的流速。 6．待檢測(cè)器預(yù)熱一段時(shí)間后，打開(kāi)色譜工作站，開(kāi)始走基線。如基線不在合適位置，可進(jìn)行零點(diǎn)校正。待基線平穩(wěn)后，可開(kāi)始進(jìn)樣。 7．將 六通進(jìn)樣閥旋轉(zhuǎn)至 LOAD 位置，用平頭注射器進(jìn)樣后，轉(zhuǎn)回至 INJECT 位置，并同時(shí)開(kāi)始采集數(shù)據(jù)，色譜處理機(jī)自動(dòng)記錄色譜峰時(shí)間、峰面積，待色譜峰流出后，停止采樣，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。 8．試驗(yàn)結(jié)束后，關(guān)閉輸液泵、柱溫箱、檢測(cè)器和色譜處理機(jī)電源 ， 關(guān)閉穩(wěn)壓電源，卸下色譜柱，并及時(shí)按色譜柱說(shuō)明書(shū)對(duì)色譜柱進(jìn)行保養(yǎng) 。 注意事項(xiàng) 1． 新色譜柱或長(zhǎng)期不用的色譜柱，應(yīng)先用甲醇活化 1030 min 后再使用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用純甲醇沖洗管路及色譜柱一段時(shí)間，如用 pH緩沖液做流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)先用蒸餾水（含5%左右甲醇 ）沖洗 30 min，再 用純甲 醇沖洗。 2．微量注射器應(yīng)使用平頭的，亦防止刺穿進(jìn)樣閥的墊圈，應(yīng)先用少量試樣洗滌多次，再慢慢抽入試樣，并稍多于需要量（一般為 23倍）。如內(nèi)有氣泡則將針頭朝上，使氣泡上升排出，再將過(guò)量的試樣排出，用瀘紙吸去針尖外所沾試樣。注意切勿使針頭內(nèi)的試樣流失。用完后用甲醇或丙酮洗滌數(shù)次。 3．流動(dòng)相應(yīng)先脫氣方可使用。更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)停泵操作，以防止氣泡進(jìn)入，更換流動(dòng)向后，應(yīng)先打開(kāi)排液閥，按 purge 鍵排出先前的流動(dòng)相。 4．輸液泵應(yīng)避免長(zhǎng)時(shí)間在高壓下（ 30 Mpa）工作。如發(fā)現(xiàn)泵壓過(guò)高，應(yīng)立即停泵，檢查是否有堵塞或其 它原因。