【正文】 決于以下三個(gè)因素： （ 1） 溶質(zhì)分子中非極性部分的總表面積； （ 2） 鍵合相上烷基的總表面積； （ 3） 洗脫液的表面張力 （ 1） 溶質(zhì)分子中的非極性部分總表面積越大，締合作用越強(qiáng)。對(duì)于一個(gè)被分離的有機(jī)化合物來(lái)講，可把整個(gè)分子看成是非極性部分和極性官能團(tuán)部分所組成。 疏溶劑作用理論以解釋單分子層鍵合相的色譜保留機(jī)理：該理論認(rèn)為非極性烷基鍵合相是在硅膠表面蒙覆了一層以 SiC 鍵化學(xué)鍵合的十八烷基（或其他烴基）的“分子毛”。 當(dāng)溶質(zhì)進(jìn)入到極性流動(dòng)相中時(shí)，分 子中的非極性部分總是趨向與其它非極性部分聚集在一起，以減少與 極性 溶劑接觸的面積．而使體系的能量最低。 （一）反相鍵合相色譜的分離機(jī)理 1．疏溶劑作用理論（ Solvophobic interaction） 當(dāng)一個(gè)溶質(zhì)分子的非極性部分與極性溶劑接觸時(shí)，相互產(chǎn)生斥力。在這種鍵合相色譜中，洗脫次序恰與正相色譜相反，即極性大的化合物先洗脫（ｋ＇?。?，極性小的化合物不易洗脫（ｋ＇大）。 3. 有機(jī)改性劑對(duì)保留的影響 如果洗脫液中加入極性有機(jī)組分（如乙醇），則抑制離子交換，并且產(chǎn)生按分配機(jī)理進(jìn)行的分離。如圖 2，在前述固定相分離腺嘌呤及胞嘧啶時(shí)，ｋ＇隨 NaH2PO4 鹽濃度的變大而減小，成反比。 （ 2）在用強(qiáng)陽(yáng)離子交換鍵合相分離堿性藥物時(shí)， pH↑→游離堿↑→ｋ＇↓，保留時(shí)間↓。如在分離有機(jī)酸混合物時(shí)，隨著 pH 值得減低，酸性弱（ pka 較大）的組分先洗脫出，然后再降低 pH，酸性較強(qiáng)（ pka 較?。┑慕M分也被洗脫出來(lái)。 由上述可見(jiàn) 流動(dòng)相的 pH 選擇應(yīng)適中，最好選擇在被分離的酸或堿的 pka 或 pkb 附近，使它們解離適中，達(dá)到最佳分離。在低 pH 值得情況下，ｋ＇重新與 pH 無(wú)關(guān)，因?yàn)檫@時(shí)堿完全被質(zhì)子化而牢固地吸附在固定相上，ｋ＇很大，不易洗脫。 pH 大于 6時(shí)，兩堿性樣品的ｋ＇都在 1~ 之間，在這樣的 pH 下，交換集團(tuán)完全是以 Na+的形式存在的，而游離的胞嘧啶及腺嘌呤無(wú)法與 Na+離子交換。例如，在分離腺嘌呤及胞嘧啶時(shí)以正丁基磺酸（鍵合 在硅膠上）作為固定相，采用 磷酸鹽緩沖液（ ~）作為洗脫液。又如在陽(yáng)離子交換鍵合相（ SO3H）上分離堿性藥物時(shí)，當(dāng) pH 過(guò)高，固定相轉(zhuǎn)變成鈉型（ SO3+Na），堿性藥物以游離堿形式存在，無(wú)交換能力，ｋ＇很小。不參加離子交換，而以分子形式幾乎無(wú)保留地通過(guò)柱子（實(shí)際上由于極性基團(tuán)微弱的吸附作用而產(chǎn)生很小的保留作用）。溶質(zhì)的保留值受流動(dòng)相的 pH 值、離子強(qiáng)度以及有機(jī)改性劑的影響，溶質(zhì)的保留兼有離子交換和吸附雙重機(jī)理。 在離子交換鍵合相色譜中，離子交換鍵合相色譜的流動(dòng)相多為控制一定的 pH 的緩沖液。全多孔微粒型固定相的交換容量較大，一般為毫克當(dāng)量水平（ ~ 毫克當(dāng)量 /克）；薄殼型由于表面積較小，一般只有微克當(dāng)量級(jí)（ 30~60 微克當(dāng)量 /克）。交換容量越大，負(fù)載能力越大，ｋ＇值也越大。特別是未鍵合的殘留硅羥基容易生成硅酸鹽。但它們的 pH 適用范圍只能在 pH 2~8。 離子交換鍵合相多以薄殼型或全多孔微粒硅膠為基質(zhì)，具有較高的耐壓性，化學(xué)及熱穩(wěn)定性。 在化學(xué)鍵合的有機(jī)硅烷分子中帶 上固定的離子交換基團(tuán)，便成了離子交換鍵合相。 2）也用作反相色譜 分離樣品：強(qiáng)極性化合物，如糖類(lèi)、多肽 腺嘌呤 胞嘌呤 K’ PH 五．離子交換鍵合相色譜 離子交換色譜早期都采用高分子聚合物（如聚苯乙烯樹(shù)脂）為基質(zhì)的離子交換樹(shù)脂作用定相。一般認(rèn)為吸附過(guò)程是主要的相互作用過(guò)程，通過(guò)填料表面極性基團(tuán)的偶極誘導(dǎo)，或氫鍵，或靜電作用 和溶質(zhì)分子發(fā)生相互作用，達(dá)到分離目的。但對(duì)強(qiáng)極性的化合物，上述極性鍵合相也可用反相色譜，如分離糖類(lèi)或多肽化合物時(shí)，用乙腈 水作洗脫液也可以得到良好的分離效果。 極性鍵合相一般都用作正相色譜，即用非極性或極性小的溶劑（如烴類(lèi)溶劑）加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇類(lèi)、乙腈等），以調(diào)節(jié)控制洗脫液的洗脫強(qiáng)度。 上述三種極性鍵合相都是一氫鍵力作用，其中氰基是一種氫鍵接受體，而后兩種兼具氫鍵接受體和給予體兩種性能。第一步是在硅膠表面先接一個(gè)正烴基或正芳基硅烷，然后再以相應(yīng)的取代反應(yīng)引入極性基團(tuán)。 極性端基：由帶極性基團(tuán)（如 NH2，ＯＨ）的烴基或芳基組成。它是整個(gè)極性鍵合基團(tuán)與硅膠母體直接相連的橋梁。 對(duì)于極性鍵合相來(lái)講，一般鍵合表面由三部分組成：鍵型、主體基團(tuán)、極性端基。商品鍵合相一般均以上述基團(tuán)命名，如 Lichrosorb NH2， uBondapak CN 等。和空白硅膠相比，這種極性鍵合相的表面能分布相對(duì)均勻，因而吸附活性比硅膠低，可以看成是一種改性過(guò)的硅膠。按鍵合相的表面結(jié)構(gòu)分為單分子鍵合和聚合鍵合；按鍵合有機(jī)硅烷的官能團(tuán)分為極性鍵合相、非極性鍵和離子交換鍵合相三種。這是基于 SiOH 基在 3750cm1處有特征的紅外吸收譜帶，借此可以獲得某些信息。這種方法評(píng)價(jià)較為多客觀。若殘余羥基甚多。若殘余羥基甚少，則象甲醇、丙酮等極性化合物的保留時(shí)間與 tm 相近。例如對(duì)反相填料在甲醇 水條件下考察對(duì)芳烴、苯、萘、聯(lián)苯的分離情況。 1017 為以微摩爾為基準(zhǔn)的阿佛加德羅常數(shù)。 有時(shí)也用表面覆蓋度表示鍵合量。由于Ｃ％隨基質(zhì)比表面積（Ｓ）和鍵合有機(jī)基團(tuán)的分子量（Ｍ）變換，所以在研究和比較的工作中采用表面鍵合相濃度α表示，即單位表面積所含鍵合相的濃度 (umol/m2) ： ? = ??SMW 式中， w 為 1g 擔(dān)體上鍵合有機(jī)物的重量（ μg）； M 為鍵合有機(jī)基團(tuán)的分子量； S為擔(dān)體比表面積（ m2/g）。測(cè)定和評(píng)價(jià)的方法有微量元素分析、色譜、光譜、核磁共振法等。在化學(xué)鍵合相色譜中，代表色譜保留ｋ＇是與鍵合在 硅膠表面有機(jī)基團(tuán)的覆蓋量直接有關(guān)，因而鍵合相表面改性的完全程度和重現(xiàn)性是色譜用戶(hù)和制造廠家共同關(guān)心的。： Kromasil 硅膠的質(zhì)量較穩(wěn)定，但柱壓較高。能經(jīng)歷 20 多年但性能基本上保持一致的 HPLC 并不多， μ BondapakTM C18 是其中一個(gè)代表性的品種。 Waters 公司： Bondapak 174。由著名的色譜科學(xué)家 Kickland 研制，并由杜邦公司所生產(chǎn)和銷(xiāo)售的系列色譜填料的注冊(cè)商標(biāo)。 S iOO HS i O H+ X 3 S i R S iOOS i OS iXR+ 3 H X S iOO HS i O H+ X 2 S i R 2 S iOOS i OS iRR+ 2 H X S i O H + X S i R 3 S i O S i R + H XSiRR(CH 2 ) 17 CH 3SiC H 3C H 3(CH 2 ) 17 CH 3XO H + monomer icbondi ng （ 3）常見(jiàn)的官能團(tuán) 十八烷基硅烷鍵合硅膠（ ODS） 氰基 苯基 氨基 （ 4）常用的鍵合相商品牌號(hào) 安捷倫公司（ Agilent）： Zorbax 174。為了進(jìn)一步消除殘留的游離硅醇基，一般在鍵合反應(yīng)后再 用一氯三甲基硅烷或六甲基二硅氨烷鈍化。 X： Cl、 OH、 OCH OC2H5 R： C8H1 C18H3 (CH2)nCN、 (CH2)nNH2 （ 2）端基封尾 (endcap)－－消除殘余的硅羥基 由于空間位阻的緣故，較大的硅烷分子不可能與擔(dān)體表面上較小的硅醇基全部發(fā)生反應(yīng)。 R 為辛烷基、十八烷基、苯基等。它是利用氯硅烷 或烷氧基硅烷與硅膠反應(yīng)而得。然后中和，在 200℃以下烘干除去物理吸附水（不得超過(guò) 200℃，否則硅醇基脫水形成硅氧烷結(jié)構(gòu)），再以過(guò)量的硅烷化試劑進(jìn)行化學(xué)鍵合。 二、制 備和性能評(píng)價(jià) （一）制備 在制備鍵合相時(shí)，首先作為擔(dān)體的硅膠需要酸處理，使表面的硅氧烷鍵打開(kāi)，形成盡可能多的自由羥基，有利于反應(yīng)。改變鍵合用有機(jī)硅烷，可得到不同的鍵合相填料，以適用于各種類(lèi)型的試樣分離。如十八烷基鍵合相的流失溫度在 220℃以上?；瘜W(xué)鍵合相色譜的固定相永久性的鍵合在擔(dān)體上，不會(huì)流失。 這是傳統(tǒng)的液 液分配色譜（ LLC）逐漸被鍵 合相色譜取代的根本原因。這是鍵合相色譜在許多方面取代液固吸附色譜的主要原因。 1. 消除了擔(dān)體上的表面活性作用點(diǎn)，清除了某些可能的催化活性。使得較早出現(xiàn)的液 固吸附色譜及液 液分配色譜大量地被鍵合相色譜所取代，某些離子型的物質(zhì)也從用傳統(tǒng)的離子交換樹(shù)脂分離改用離子交換鍵合相或反相離子對(duì)色譜分離。硅膠表面存在著足夠的可反應(yīng)硅膠基，再加上硅膠本身的許多特點(diǎn)，例如強(qiáng)度好，孔結(jié)構(gòu)和表面積易于人為控制，有較好的化學(xué)穩(wěn)定性等，因而是各種化學(xué)鍵合相理想基質(zhì)材料。硅 膠表面硅原子主要以硅醇基（≡ SiOH）和硅氧烷形成存在，這種硅醇基是進(jìn)行鍵合的活性官能團(tuán)。硅膠（ SiO2 要形成化學(xué)鍵合固定相，有兩個(gè)必要條件：一是所用的擔(dān)體材料應(yīng)有某種化學(xué)反應(yīng)活性，如硅膠、氧化鋁、硅藻土等表面都具有化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán)；但以硅膠為最理想的和最常用。據(jù)統(tǒng)計(jì)。經(jīng)這樣處理后，柱壓可長(zhǎng)期保持不變，達(dá)到保護(hù)柱子的目的。 4. 非解離型物質(zhì)在該系統(tǒng)的出峰順序類(lèi)似于 RPHPLC（硅氧烷基疏水） （三）柱子的培養(yǎng) 由于流動(dòng)相中含有三乙胺，三乙胺吸附在硅羥基上。（ 2） pH 值太高弱堿性藥物不易離子化。流動(dòng)相的 pH 值以 pH 6~7 為好。一方面，增大 pH 值，硅醇基解離程度提高，離子交換特性增強(qiáng)，使保留時(shí)間增大。流動(dòng)相中三乙胺為陰離子競(jìng)爭(zhēng)離子，用于競(jìng)爭(zhēng)硅羥基，以消除硅羥基對(duì)生物間的吸附。適合于分離 在反相 HPLC 中不宜分離的生物堿類(lèi)混合物（反相 HPLC 中生物堿可能拖尾及峰展寬，有時(shí) tR 相差很大）。該法的色譜保留機(jī)理相當(dāng)于離子交換機(jī)理，主要依堿性強(qiáng)弱出峰。 該方法的保留機(jī)制是基于硅膠表面的硅羥基在一定的條件下具有離子交換特性，改變?nèi)我涣鲃?dòng)相條件（ pH, 離子強(qiáng)度，含水量），都會(huì)對(duì)保留時(shí)間產(chǎn)生影響。 三、正相硅膠反相洗脫（ NS/RE）色 譜法 （一）固定相 本法采用未改性的原形硅膠為固定相，以水性溶液作流動(dòng)相。 （三）流動(dòng)相 采用與固定液性質(zhì)相差很大的不混溶的溶劑為流動(dòng)相，流動(dòng)相使用前需預(yù)先用固定液飽和，或在分析柱前增加預(yù)飽和柱，以避免固定液流失。如在紙色譜里，甾體藥物可以在浸漬甲酰胺 的紙上容易地分離，如果把甲酰胺涂在硅膠上，那么甾族化合物就能用高效液相色譜分離，因?yàn)榧柞０芳词乖谥械葮O性的溶劑苯、二氯甲烷中也幾乎是不溶解的。但由于許多有機(jī)物樣品在上述洗脫液中的溶解度很小，所以這類(lèi)體系的適用性是有限的。然而，對(duì)這些固定液，適合作為流動(dòng)相的只有非極性鏈烴，最多再加入少量（最高 10%）