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色譜分析中國藥科大學(xué)第4章第1-6節(jié)高效液相色譜分析-在線瀏覽

2025-02-23 23:17本頁面
  

【正文】 的流動相為:乙醇(或甲醇) — 1~3%三乙胺水溶液(磷酸或醋酸調(diào)節(jié) pH值至 6~)( 85: 15)或( 80: 20)。色譜峰的對稱性很好,峰形尖銳。 影響 NS/RE 色譜保留的因素如下: 1. 水的比例增加,洗脫能力減??; 2. 三乙胺濃度升高,對含堿性基團(tuán)組分的洗脫能力提高,保留時間縮短。 3. pH 值對 NS/RE 的色譜保留具有兩面性。但另一方面,對于堿性化合物,增大 pH會壓制該化合物的解離,反而會使保留時 間縮短。原因有三:( 1) pH 太低,硅羥基失去離子交換能力。( 3) pH 值太高,硅叫在堿性溶液中有一定的溶解度。很難以甲醇清洗,所以每次做完樣品,先以 %冰乙酸沖洗 1520min,洗去三乙胺,然后再用甲醇沖洗 20min。 第三節(jié) 化學(xué)鍵合相色 譜 一、 意義和特點 化學(xué)鍵合相色譜使用的固定相是借助于化學(xué)反應(yīng)的方法將有機(jī)分子以共價鍵連接在色譜擔(dān)體上的,主要用于反相、正相、離子交換及離子對色譜中。鍵合相色譜在高效液相色譜的整個應(yīng)用中占 80%以上。二是有機(jī)分子應(yīng)含有能與擔(dān)體表面發(fā)生反應(yīng)的官能團(tuán)(詳見下節(jié)討論)。xH2O)之所以是理想的化學(xué)鍵合相擔(dān)體,主要由它的表面性質(zhì)所決定。 SiOH Si O SiO 自由型硅醇基 硅氧烷型 按照晶體點陣計算,硅膠表面羥基數(shù)目可達(dá)到 8 個 /nm2,但用化學(xué)方法測定的羥基數(shù)一般認(rèn)為是約 5 個 /nm2。 化學(xué)鍵合相在 HPLC 中的應(yīng)用,引起了一場巨大的變革。歸納起來,化學(xué)鍵合相主要有以下幾個優(yōu)越性。 這樣就緩和了一些復(fù)雜樣品在固定相表面上的不可逆化學(xué)吸附,使得操作簡化,峰形對稱;對溶劑中微量水分含量的變化要求不苛刻;此外,溶劑的殘留效應(yīng)小,梯度沖洗平衡快。 2. 耐溶劑沖洗。 LLC 中固定液的流失十分嚴(yán)重,為了克服這個缺點,曾采取溶劑預(yù)先用固定液飽和及柱前增加預(yù)飽和柱的方法,但這樣做既不方便,柱系統(tǒng)的穩(wěn)定性也差。 3. 熱穩(wěn)定性好 每種鍵合相均有其相應(yīng)的最高使用溫度,在此溫度下可進(jìn)行升溫 HPLC。 4. 表面改性靈活,容易獲得重復(fù)性產(chǎn)品 ??刂乒枘z的質(zhì)量和鍵合工藝,可得到重復(fù)性產(chǎn)品。 OSiSi O H+O HSi OO HSiH O2 酸處理也可除去表面層的金屬氧化物雜質(zhì)和孔隙中的細(xì)粉。 ( 1)反應(yīng) 鍵合反應(yīng)的類型: SiOSiC 鍵型(硅膠與有機(jī)硅烷反應(yīng)產(chǎn)物) 這是一類目前占絕對優(yōu)勢的鍵合相類型,具有良好的熱穩(wěn)定性及化學(xué)穩(wěn)定性,能在 pH 2~ 的介質(zhì)中使用。 Si O H SiC H 3C H 3X R Si O SiC H 3C H 3R+ X 為 Cl、 CH3O 或 C2H5O。 如 BondapakC18 鍵合相,即為 R = 十八烷基。因而殘余羥基是不可避免的。也可用十八烷基三氯硅烷再鍵合一次。Zorbax 174?,F(xiàn)在,Zorbax 的全部生產(chǎn)線已并入 Agilent 公司。、 μ BondapakTM、 XterraTMμ BondapakTM C18 性能重現(xiàn)性非常好。 瑞典 Akzo Nobel 公司: Kromasil 174。 Merck 公司: LiChrosorb、 LiChrospher、 Nucleosil SiRR(CH 2 ) 3 C NSiRR(CH 2 ) 3 CCCCCCH HHHHSiRR(CH 2 ) 17 CH 3(二)化學(xué)鍵合相性能評價 由于各種鍵合相均以硅膠為基質(zhì),可以認(rèn)為是一種改性硅膠。重復(fù)性和改性完全程度可通過殘余羥基,覆蓋度和覆蓋均勻性表示。 1. 微量元素分析或熱失重法 本法直接測定鍵合相的碳含量: 100%% ??擔(dān)體的重量 的重量鍵合相中 CC 這個值在2~29%之間變化。 W 用碳含量表示: W= ??? MNcC12 % 106 式中, 12 為碳的原子量; Nc 為鍵合有機(jī)基團(tuán)的碳數(shù)。 表面覆蓋度 =醇基的微摩爾數(shù)單位表面含有可反應(yīng)硅 的微摩爾數(shù)單位表面鍵合有機(jī)基團(tuán)=1718105??? = ? 這里假定硅膠表面可反應(yīng)的硅膠基數(shù)目為 5 個 /nm2, 179。 2. 色譜法 鍵合相的性能用色譜方法評價是很自然的,因為它最終用于色譜,所以生產(chǎn)廠家一般都給出產(chǎn)品附上特定標(biāo)準(zhǔn)物苯及聯(lián)苯的保留值和柱效率,或者其它參數(shù)的測試結(jié)果。也有人提出用非極性鍵合相填料正相洗脫的 方法檢查殘余羥基的含量,即用庚烷作流動相。且峰形對稱。則情況相反。 3. 光譜法 光譜法也是考察填料表面羥基含量的重要手段。 三、 分類 化學(xué)鍵合相的分類可以有不同的依據(jù)。 四.極性鍵合相色譜 極性鍵合相指鍵合有機(jī)分子 中含有某種極性基團(tuán)。最常見的極性鍵合相有氰基( CN, Cyano)、二醇基( diol)、氨基( NH2, amino)等。也有的商品鍵合相并不注明是什么基團(tuán)。 鍵型:如 SiOSiC。 主體基團(tuán):一般由直鍵烴基或醚基所組成,其作用為使硅膠表面與特定的極性基團(tuán)之間保持一定距離。 大多數(shù)情況下,極性鍵合相的制備分三步進(jìn)行。由于空間位阻的影響,上述反應(yīng)不能象相似相溶液那樣完全,一般靠碳和氮含量來計算表面覆蓋程度。對于有較強(qiáng)氫鍵作用力的樣品,在后兩種鍵合相上的保留值大,所得k'值也大。分離組分的出峰順序與組分的極性大小順序相同,即極性弱的先出峰,極性強(qiáng)的后出峰。 極性鍵合相的保留機(jī)理既有吸附的因素,也有分配的因素。 極性鍵合相色譜提綱: 鍵合表面的基團(tuán)組成 鍵型: SiOSiC或 SiOSiN 主體基團(tuán):直鏈烴基或醚基 極性的端基:氨基( NH2)、氰基( CN)、二醇基( diol)、芳硝基、醚基 LiChrosorb NH LiChrosorb Diol分離機(jī)理 作用力:氫鍵力 氰基:氫鍵接受體 氨基、二醇基:氫鍵接受體與給予體 聯(lián)苯胺、苯胺 k’: 氨基 氰基(學(xué)生思考原因) 色譜分離方式 1)一般用作正相色譜 流動相:弱極性溶劑 + 適量極 性溶劑 (烴類) (氯仿、醇、乙腈) 溶質(zhì)保留規(guī)律: A 溶質(zhì)的分離是基于親水結(jié)構(gòu)的差異; B 溶質(zhì)的極性越大,保留值越大; C 流動相極性越大,洗脫強(qiáng)度越大。在 HPLC 中,這種固定相由于溶脹性,不耐高壓,以及表面的微孔型結(jié)構(gòu)影響傳質(zhì)速率,現(xiàn)已被離子交換鍵合相所代替。若帶上磺酸基 (SO3), 羧酸基( COOH),就是陽離子交換劑,若帶上季氨基( R4N+)或氨基( NH4)就是陽離子交換劑。由于有較好的機(jī)械強(qiáng)度,耐壓,這類微粒型鍵合相可以高壓勻漿裝柱。 pH> 9 時,硅膠便容易溶解。 離子交換容量是很重要的。離子交換鍵合相的 交換容量與固定相的表面積直接有關(guān)。交換容量可用酸堿滴定法測定。流動相中往往加入有機(jī)成分作為改性劑。 1. pH 值對保留時間的影響 弱酸及弱堿的保留值與洗脫液的 pH 值有關(guān),它們或者先解離并 參加離子交換而被分離;或者不解離。 在強(qiáng)陰離子交換鍵合相上分離弱酸性有機(jī)陰離子時,當(dāng) pH 過高(如 pH> 7 時),有機(jī)酸完全電離,牢固地吸附在固定相上,k'很大,難于洗脫,此時便于無分離作用。也無法達(dá)到分離目的。不同的 pH 對k'的影響見圖 1。當(dāng) pH 值減小時,堿性樣品的k'值增加。曲線的轉(zhuǎn)折點近似相當(dāng)于兩堿性藥物的 pkb 值,在這種情況下,堿與它們的鹽以 1: 1 的比例平衡。 為提高分離度,可采用不同 pH 的緩沖液作為梯度淋洗,通過選擇適當(dāng)?shù)南疵摋l件,可以得到很好的分離效果。 ( 1)在用強(qiáng)陰離子交換鍵合相分離酸性藥物時, pH↑→藥物解離度↑→k'↑,保留時間↑。 2. 離 子強(qiáng)度對保留值得影響 離子強(qiáng)度(緩沖鹽濃度)增加,k'減小。 原因歸結(jié)于離子交換平衡的移動。六、非極性鍵合相色譜( Nonpolar bonded phase chromatography) 又稱反相鍵合相色譜( Reversed phase chromatography) , 這主要是因為所用的鍵合固定相表面都 是極性很小的烴基,如十八烷基、辛烷基、甲基、苯基等,而洗脫液大都采用強(qiáng)極性溶劑(水、醇、乙腈)或無機(jī)鹽的緩沖液。該類鍵合相中最常用的是十八烷基硅烷鍵合硅膠,又稱 ODS。這種效應(yīng)稱為“ 憎水 ” 或 “ 疏溶劑效應(yīng) ” 。圖中黑箭頭表示疏溶劑力,空心箭頭表示溶質(zhì)分子與極性溶劑的作用力。 這種構(gòu)成“分子毛”的長鍵烴基具有強(qiáng)的疏水特性。溶質(zhì)分子與鍵合相表面的烷基之間的疏溶劑作用是 溶質(zhì)分子 S 與鍵合烷基 L 間的一種可逆締合作用。 在一定的洗脫液和溫度下, logk'與該總表面積成正比。 ( 2) logk'與鍵合相表面烷基的總表面積也成線性關(guān) 系,烷基越大,k'越大。 烷基碳鏈越長,溶質(zhì)保留越強(qiáng) 圖 2 為幾種酚類化合物在不同長短碳鏈的非極性鍵和相上所得 logk'比較, OH 數(shù)越多,k'越小,鍵合相鏈長越長,k'越大。表面張力越大,則 S 與 L 締合時釋放的能量越多,k'也越大。其表面張力就越小,k'也隨之減小,如果把電解質(zhì)(如緩沖液或中性鹽)加入到洗脫液, 則表面張力隨著鹽濃度的增加而增加,k'也就越大。如醇 水洗脫液中增加醇的比例k'就減小,增加水的比例k'就增加。 2.雙保留機(jī)理 烷基鍵合相表面往往還有殘余硅醇基,這是一種微量酸性的基團(tuán),可與溶質(zhì)陽離子或氫鍵基團(tuán)相互作用,這種作用叫做“親硅醇基效應(yīng)”( Silanophilic interaction)。 logk’ 鍵合相固定液 O H O HO H OHO H O H 色譜中的雙保留機(jī)理往往導(dǎo)致一些不利的影響,如柱效低,峰形拖尾等。 (二)流動相 反相 HPLC 的流動相一般選擇 ( 1) 甲醇 — 水及( 2) 乙腈 — 水兩種系統(tǒng)。 系統(tǒng)( 2) 較系統(tǒng) ( 1) 好,原因如下: A) 系統(tǒng)( 2) 的粘度較系統(tǒng) ( 1) 小,柱效好些。 1.對于中性藥物而言 ( 1)待測物極性較大時,則選擇:水相比例較大。即( 20: 80) — ( 35: 65) 例 1. 柴胡皂甙 C( Saikosaponin C) OOC H2O HO HO HO HOOOO HOC H2O HO HOC H3O HO H O H 色譜柱: YWG ODS A311 ( mm, .179。 25 cm) 流動相:甲醇:水( 35:
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