血清蛋白的醋酸薄膜電泳-資料下載頁
2025-01-06 09:06本頁面
【正文】 特點(diǎn)加以選擇 。 其原則是染料對被分離樣品有較強(qiáng)的著色力 ， 背景易脫色；應(yīng)盡量采用水溶性染料 ，不宜選擇醇溶性染料 ， 以免引起醋酸纖維素薄膜溶解 。 ? 應(yīng)控制染色時間 。 時間長 ， 薄膜底色深不易脫去；時間太短 ， 著色淺不易區(qū)分 ， 或造成條帶染色不均勻 ， 必要時可進(jìn)行復(fù)染 。 ⑹透明及保存 ⑹ 透明及保存 ? 透明液應(yīng)臨用前配制 ， 以免冰乙酸及乙醇揮發(fā)而影響透明效果 。 這些試劑最好選用分析純 。 透明前 ， 薄膜應(yīng)完全干燥 。 透明時間應(yīng)掌握好 ， 如在透明乙液中浸泡時間太長則薄膜溶解 ， 太短則透明度不佳 。 ? 透明后的薄膜完全干燥后才能浸入液體石蠟中 ，使薄膜軟化 。 如有水 ， 則液體石蠟不易浸入 ， 薄膜不易展平 。 ?【 實(shí)驗(yàn)方法 】 ? 1．準(zhǔn)備與點(diǎn)樣 ? (1)將薄膜切成 cm 8 cm的小片。在薄膜無光澤面 (正面 )的一端約 2 cm處用硬鉛筆劃一點(diǎn)樣線。 ? (2)將薄膜無光澤面向下，置巴比妥緩沖中， 使膜條自然浸濕 。 ? (3)將充分浸透的膜條取出，用濾紙吸去多余的緩沖液，把膜條置潔凈濾紙上。 ? (4)用載玻片點(diǎn)樣。 ? 2．電泳 ? 將點(diǎn)樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時，無光澤面 (即點(diǎn)樣面 )向下，點(diǎn)樣端置于陰極，槽架上以四層濾紙作橋墊，膜條與濾紙需貼緊，待平衡 5 min后通電，電壓為 110 V，電流為 ～ mA/cm，通電 1 h左右關(guān)閉電源。 ? 3．染色 ? 通電完畢后用鑷子將薄膜取出，直接浸于氨基黑 10B的染色液中，染 5 min取出，立即浸入盛有漂洗液的培養(yǎng)皿中，反復(fù)漂洗數(shù)次，直至背景漂凈為止。用濾紙吸干薄膜。 ? 4．定量 ? 本實(shí)驗(yàn)不要求進(jìn)行定量分析，如有需要，可采用薄層掃描儀進(jìn)行掃描定量，或采用洗脫后再進(jìn)行比色的方法進(jìn)行定量。下面為后者的具體操作步驟： ? 取試管 6支，編好號碼，分別用吸管取 mol/L氫氧化鈉 4 ml，剪開薄膜上各條蛋白色帶，另于空白部位剪一平均大小的薄膜條，將各條分別浸于上述試管內(nèi)，不時搖動，使藍(lán)色洗出。約 h后，用分光光度計(jì)進(jìn)行比色，波長用 650 nm，以空白薄膜條洗出液為空白對照，讀取白蛋白 A， α1， α2， β， γ球蛋白各管的吸光度。 ? 5．計(jì)算 ? 吸光度 ∑T＝ A＋ α1＋ α2＋ β＋ γ ? 各部分蛋白質(zhì)的百分含量為： ? 白蛋白％＝（ A / ∑T） 100％ ? α1球蛋白％＝（ α1/ ∑T） 100％ ? α2球蛋白％＝（ α2/ ∑T） 100％ ? β球蛋白％＝（ β/ ∑T） 100％ ? γ球蛋白％＝（ γ/ ∑T） 100％ ? 【 實(shí)驗(yàn)思考 】 ? 1．電泳時，點(diǎn)樣端置于電場的正極還是負(fù)極？為什么？ ? 2．電泳后，泳動在最前面的是何種蛋白質(zhì)？各譜帶為何種成分？請分析原因。
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