疾病基因序列分析ppt課件-資料下載頁
2025-01-05 13:48本頁面
【正文】 ? 退火溫度設(shè)臵過低，會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；退火溫度過高，則影響引物與模板的結(jié)合而降低 PCR效率。 ? 在退火時(shí)間里，引物與模板相結(jié)合，時(shí)間太短會(huì)使引物與模板未完全結(jié)合而導(dǎo)致無法延伸；時(shí)間過長(zhǎng)容易產(chǎn)生引物在模板上的非特異性結(jié)合或形成引物二聚體。退火時(shí)間設(shè)臵為 30s基本上就足夠了。 ? 所用 DNA聚合酶的最佳活性溫度決定了延伸溫度，如 Taq聚合酶的最佳溫度為 70～ 80度，所以延伸溫度設(shè)為 72℃ 即可。 ? 在實(shí)踐中 Taq DNA聚合酶的延伸效率約為 500 bp/30 s，若待擴(kuò)增的片段較長(zhǎng)，可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，但時(shí)間過長(zhǎng)又會(huì)致非特異性擴(kuò)增。 ? 在經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后，隨著聚合酶活性的降低，引物濃度降低等因素， PCR產(chǎn)物不再呈指數(shù)增加，此時(shí)稱為平臺(tái)效應(yīng)。 ? 循環(huán)次數(shù)設(shè)為 25~30次，即可滿足一般的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。過多的循環(huán)次數(shù)會(huì)導(dǎo)致堿基錯(cuò)配增加和非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)。 1. DNA模板：以 pPIC9NGAL為模板，來擴(kuò)增不包含信號(hào)肽序列的 NGAL編碼區(qū) 2. 引物： PCR上游引物（ P1）： 5′ CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 3′ PCR下游引物（ P2）： 5′ CGGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC 3′ 底下有橫線的堿基為酶切位點(diǎn)： XholI (P1)， EcoRI(P2) 3. 2 Taq PCR Master Mix （廣州佰路生物科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品成份為： U Taq DNA Polymerase/ml 500 mM dNTP each 50 mM TrisHCl () 20 mM KCl 4 mM MgCl2 4. 無菌水 5. 100bp plus ladder DNA marker 本實(shí)驗(yàn)所用試劑 實(shí)驗(yàn)操作 95℃ 2min 94℃ 30s 60℃ 30s 72℃ 30s 72℃ 5min 30個(gè)循環(huán) 1. 按以下次序?qū)⒏鞒煞旨?PCR管中。 2 Taq PCR MasterMix 5 181。l P1 ( 181。M ) 1 181。l P2 ( 181。M) 1 181。l 無菌水 2 181。l pPIC9NGAL 1 181。l 反應(yīng)體系： 10 181。l 混勻，稍加離心并標(biāo)記。 2. PCR反應(yīng)于 ABI 2720 Thermer cycler進(jìn)行， PCR反應(yīng)條件： ? 凝膠準(zhǔn)備 ① 稱 1g瓊脂糖臵三角瓶中，加 100ml 1 TAE； ② 微波爐加熱大約 2分鐘，熔化瓊脂糖； ③ 熔化的瓊脂糖自然冷卻到 60～ 70℃ 時(shí)，加入 EB 5μl，并輕輕混勻。 ? 膠床準(zhǔn)備 ① 將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和床面有 1mm的間隙； ② 將膠床放在調(diào)整好的水平臺(tái)上； ? 鋪膠：將冷卻致 60℃ 的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠床內(nèi)，凝膠厚度約 5 mm； ? 室溫下靜臵 30分鐘左右，凝膠固化。將帶凝膠 的膠床臵于電泳槽中，并使樣品孔位于電場(chǎng)負(fù)極； 第四部分 PCR產(chǎn)物電泳鑒定 ? 向電泳槽中加入 1 TAE電泳緩沖液，越過凝膠表面即可； ? 輕輕拔出固定在凝膠中的梳子； ? 樣品準(zhǔn)備：向核酸樣品中加入約為樣品體積 1/6的上樣緩沖液，用加樣器輕輕混勻 ? 上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中，加樣量為 10μl ? 蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳； ? 電泳條件：電壓 80v；時(shí)間 20～ 25分鐘； ? 電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠； ? 電泳結(jié)果分析： ① 紫外檢測(cè)儀直接觀察電泳條帶 ② 攝影記錄 瓊脂糖凝膠電泳預(yù)期結(jié)果： 500 bp 560 bp ? PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序：從瓊脂糖凝膠中回收 PCR產(chǎn)物后測(cè)序。 ? PCR產(chǎn)物連接到載體后測(cè)序：從瓊脂糖凝膠中回收 PCR產(chǎn)物，利用連接酶將 PCR產(chǎn)物連接到載體如 pGEMT后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒后測(cè)序。 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 3130 基因分析儀 ? 24 小時(shí)無人監(jiān)控操作 ? 儀器設(shè)臵更方便更簡(jiǎn)單 ? 新型自動(dòng)灌膠系統(tǒng)進(jìn)行灌膠 ? 檢測(cè)池加熱器改進(jìn)了溫度控制 ? 通過 96 孔和 384 孔板自動(dòng)進(jìn)樣 ? 多色熒光檢測(cè) 第五部分 PCR產(chǎn)物測(cè)序鑒定 觀看測(cè)序結(jié)果的軟件 Chromas 軟件運(yùn)行界面 打開一個(gè)測(cè)序結(jié)果 峰型排列良好，無高大雜峰，說明測(cè)序結(jié)果可靠 將測(cè)序結(jié)果輸出為文本文件 雖然現(xiàn)在的 PCR技術(shù)使 PCR擴(kuò)增有很高的真實(shí)性，即 PCR產(chǎn)物與模板DNA的一致性很高，但由于 PCR擴(kuò)增畢竟是在試管內(nèi)進(jìn)行的 DNA復(fù)制，沒有類似細(xì)胞內(nèi) DNA錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制，所以，在 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增以后，仍要分析其與模板 DNA的是否完全一致。 最好的方法是將 PCR產(chǎn)物測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫作序列比對(duì)分析。 第六部分 目的基因序列變異分析 核酸序列比對(duì) BLAST分析界面 輸入測(cè)序結(jié)果 結(jié)果界面之一 結(jié)果界面之二
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