[醫(yī)學(xué)]chapter5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外擴(kuò)增dna-資料下載頁
2025-01-03 23:28本頁面
【正文】 與靶 RNA互補(bǔ)的寡核苷酸 520 pmol/L Oligo(dT)1218 μg 隨機(jī)六核苷酸 15 μg 設(shè)置 3個(gè)陰性對照： 1：不加模板，其它均加入 2：不加反轉(zhuǎn)錄酶，其它均加入 3：不加引物，其它均加入 應(yīng)用 mRNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增 cDNA（ RTPCR） 3. 將反應(yīng)管在 95℃ 加熱 5min，使反轉(zhuǎn)錄酶失活和RNAcDNA雜合物變性。 4. 調(diào)整反應(yīng)混合液體積以便使正義和反義引物濃度在 20 pmol/L。 5. 離心管內(nèi)加入以下反應(yīng)試劑： 1 擴(kuò)增緩沖液和 12單位熱穩(wěn)定 DNA聚合酶。 6. 按照 PCR方法設(shè)定 PCR程序。 7. 電泳檢測 PCR擴(kuò)增結(jié)果。 DNA片段的快速鑒定 已轉(zhuǎn)化的重組載體的細(xì)菌細(xì)胞或 λ 噬菌體顆?？赏ㄟ^直接從培養(yǎng)皿上挑取菌落或噬菌斑獲得，然后直接加入到 PCR混合液中。 PCR混合液中含有除熱穩(wěn)定 DNA聚合酶外的所有試劑，其中引物要與所需鑒定的已克隆的 DNA片段互補(bǔ)。 先將 PCR混合液加熱煮沸幾分鐘，使 DNA模板從細(xì)菌細(xì)胞或噬菌體顆粒中釋放出。 再加入熱穩(wěn)定 DNA聚合酶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的 PCR反應(yīng)。 PCR 對于大片段基因，標(biāo)準(zhǔn) PCR有時(shí)達(dá)不到要求： 1. PCR高溫條件使緩沖液失去對正常 pH范圍的緩沖能力，從而損壞模板和產(chǎn)物 DNA。 2. 變性存在困難 3. DNA聚合酶難以與模板 DNA接近、結(jié)合，致使DNA聚合酶不能發(fā)揮催化功能。 4. Taq DNA聚合酶缺乏校正功能，具有較高頻率的錯(cuò)誤堿基的摻入。生長鏈 3’末端的不匹配堿基的摻入會(huì)導(dǎo)致 DNA聚合酶的失靈，從而限制PCR產(chǎn)物的長度。 如何解決標(biāo)準(zhǔn) PCR難以擴(kuò)增長片段 DNA的問題？ 1. 適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)條件。 2. 應(yīng)用兩種不同的熱穩(wěn)定 DNA聚合酶一起催化PCR擴(kuò)增反應(yīng)，消除生長鏈 3’末端的不匹配堿基的摻入的難題。 其中一種 DNA聚合酶可以催化擴(kuò)增反應(yīng)高度有效、生長鏈延伸很長但易發(fā)生不配對堿基摻入的聚合酶； 另外一種聚合酶提供 3’5’核酸外切酶功能，能及時(shí)切除不匹配堿基的摻入（ Pfu酶）。 PCR 反向 PCR（ inverse PCR）：擴(kuò)增與已知 DNA序列某一個(gè)末端相鄰的側(cè)翼的未知 DNA序列，這種未知序列沒有引物可以利用。 一般步驟： 1. 對含有已知序列以及側(cè)翼區(qū)域的基因組 DNA樣品用一種在靶序列中無切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化，形成多種片段。 2. 酶切片段自身環(huán)化連接，并作為 PCR擴(kuò)增的模板。 3. 用一對與已知序列的兩端特異性結(jié)合的引物，通過兩個(gè)方向向夾在中間的未知序列擴(kuò)增。 反向 PCR示意圖 PCR Real time Quantitative PCR： 在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè) PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。 普通 PCR技術(shù) ： 在 PCR結(jié)束后對終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。 實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù) ： 實(shí)時(shí)檢測 PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對起 始模板進(jìn)行定量。 實(shí)時(shí)定量 PCR的應(yīng)用范圍 1. DNA 或 RNA 的絕對定量分析：包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測， RNAi 基因失活率的檢測等。 2. 基因表達(dá)差異分析：例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異 (如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 )，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異等。 3. 基因分型：例如 單核苷酸多態(tài)性 SNP 檢測，甲基化檢測等。 熒光閾值 是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在 熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置 上，一般熒光域值的設(shè)置是 基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。 每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值 （ threshold value ）。 熒光閾值和 CT值 定量 PCR的數(shù)學(xué)原理 SYBR Green 法 SYBR Green 熔解曲線分析 SYBR Green法優(yōu)缺點(diǎn) TaqMan探針法 TaqMan作用機(jī)理 TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn)
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