[中醫(yī)中藥]丹參鑒定學(xué)專論-資料下載頁
2024-12-07 22:33本頁面
【正文】 總計(jì) 50 97 95. 10 0. 2389 1/3/2022 ? 結(jié)論 ：不同產(chǎn)地丹參的遺傳分化根據(jù) POPGENE計(jì)算不同產(chǎn)地丹參間 Nei無偏遺傳距離與遺傳一致性見表 3。 10個(gè)產(chǎn)地的丹參間 ,產(chǎn)自山西運(yùn)城的丹參 (SSXYC)與來自江蘇濱海的丹參 (SJSBH)的遺傳距離最小 ,為 0. 099 6。而來自山西運(yùn)城的丹參 ? (SSXYC)與來自山東的丹參 (SSD)的遺傳距離最大 ,為 0. 377 7。遺傳一致性正好與遺傳距離相反 ,遺傳距離最小的兩個(gè)產(chǎn)地的丹參 ,遺傳一致性表現(xiàn)的最大 , SSXYC與 SJSBH之間的遺傳一致性最大 ,為 0. 905 2,表明它們之間的親緣關(guān)系最近。江蘇 3個(gè)產(chǎn)地居群的遺傳一致性介于 0. 826 7與 0. 838 9之間 ,平均 0. 833 9。山東 3個(gè)產(chǎn)地的丹參遺傳一致性介于 0. 689 8與0. 808 8之間 ,平均 0. 759 7,表明不同產(chǎn)地的丹參間存在明顯的遺傳分化。 1/3/2022 第四部分 高質(zhì)量的丹參葉片 DNA的提取方法研究 1/3/2022 材料和方法 ? 樣品的采集及預(yù)處 ? 2022年 7月 ~9月份在泰山采集白花丹參的成熟葉片 ,涼干保存 1個(gè)月。 ? 試劑和儀器 ? 1 試劑 CTAB(上海生工 ),Vc(北京鼎國(guó) ),SDS (上海生工 ), PVP (上海生工 ),βmercaptoethanol(上海生工 ),Taq酶(Takara),AFLP corereagent kit(invitrogen,Cat No 1084016)。 ? 2 儀器 PTC100基因擴(kuò)增儀 (MJ公司 ),Allegra TM 64R centrifuge(BECKMAN)離心機(jī) ,DNA離心真空干燥器(Savant),EC60090 (EC apparatus corporation)高壓電泳儀 1/3/2022 方法 ? 改良 CTAB法 :用常規(guī) CTAB法作為基本方法 ,添加一些抗氧化劑和提高CTAB的比例。處理 A:提取液中加 Vc干粉末 30 mg (15mg/mg葉片 )。處理 B(PVP預(yù)洗法 ):加 PVP粉末 (干葉量的 10%),與干葉共同在液氮下研碎。加入 4℃ 預(yù)冷的 CTABfree buffer(02 M Triscl pH80, 005 MEDTA,025 M NaCl,內(nèi)含 4%βmercaptoethanol),冰上放置 10 min,7000 rpm(不能太高 ,否則膜破 ,DNA損失 ),4℃ ,離心 10 min,棄上清。然后加 Vc干粉末 (1 mg/mg干葉片 )于 4 CTAB提取液中 ,調(diào) pH值為 60~65 ? DNA瓊脂糖電泳及濃度和純度的測(cè)定 用 08%瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)測(cè)定 OD260/OD280的方法判定 DNA的質(zhì)量。 ? AFLP進(jìn)一步分析 DNA質(zhì)量 取 250 ngDNA用 EcoRI/Mse I消化 ,限制酶切片段經(jīng) T4DNA連接酶與接頭連接及 PCR擴(kuò)增 ,變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 ,銀染顯色 ,以構(gòu)建出重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的基因組 DNA AFLP指紋圖譜來進(jìn)一步評(píng)價(jià) DNA質(zhì)量。具體方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。引物組合為 (EAAG: GAC TGC GTA CCAATT CAA G。 MCCC:GAT GAG TCC TGA GTAACC C)。 1/3/2022 結(jié) 果 ? 泰山白花丹參干葉片 DNA質(zhì)量分別采用常規(guī) CTAB法、高鹽低 PH法和改良的 CTAB法提取白花丹參成熟干葉片 DNA,結(jié)果表明 ,常規(guī) CTAB法、高鹽低 pH法 ,改良 CTAB中的處理 A得到的總 DNA都呈淺黃色至淺棕色 ,其余處理顏色較好 (表 1)。高鹽低 pH法 ,改良 CTAB得到的 DNA OD260/OD280比值正常 ,為 17~20,其余的方法比值較低 (表 1)。瓊脂糖電泳分析說明 ,常規(guī) CTAB法和高鹽低 pH法可能蛋白質(zhì)去除不徹底 ,點(diǎn)樣孔雜質(zhì)較多 。改良 CTAB中的處理 A的 DNA量少 (表 1),說明單獨(dú)使用 Vc時(shí)量不能太高 。而處理 B的 DNA量和蛋白質(zhì)去除效果均較好。 ? 1/3/2022 4種方法提取白花丹參成熟干葉基因組 DNA的產(chǎn)率及純度 方法 顏色 OD260/OD280 DNA 產(chǎn)率(ng/mgFW 常規(guī) CTAB 法淺棕色 98 高鹽低 pH法 淺黃色 123 改良 CTAB處理 A淺棕色 45 改良 CTAB處理 B白色 85 圖 1 4種方法提取白花丹參成熟干葉基因組 DNA電泳圖 13常規(guī) CTAB法 。46改良 CTAB中的處理 A。79高鹽低 pH法 。1013改良CTAB中的處理 B。 1/3/2022 AFLP實(shí)驗(yàn)分析 DNA質(zhì)量 將采取不同方法提取的 DNA做 AFLP分析 ,結(jié)果顯示 ,常規(guī) CTAB法、高鹽低 PH法 ,改良CTAB中的處理 A得到呈淺黃色至淺棕色的總 DNA,AFLP擴(kuò)增都沒有產(chǎn)物 ,而改良 CTAB中的處理 B擴(kuò)增效果較好?？磥硖崛∫旱念伾疃?(含有較多酚類物質(zhì) )與擴(kuò)增結(jié)果呈明顯負(fù)相關(guān) ,文獻(xiàn)報(bào)道去除多酚類物質(zhì)效果較好的高鹽低 PH法也不奏效。 圖 2 白花丹參基因組 DNA的 AFLP分析 12常規(guī) CTAB法 。34改良 CTAB中的處理 A56高鹽低 pH法 。78改良 CTAB中的處理 B 1/3/2022 謝謝大家！ 主講：許安安 制作：李鑫 資料收集：沈雨 胡慧芬 黃河 涂志超
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