【正文】 間結(jié)合距離均小于 7nm1 通過(guò)比較葛根素及其磷?；a(chǎn)物與 BSA 的相互作用 , 初步探討了三個(gè)小分子分子結(jié)構(gòu)與其結(jié)合能力之間的聯(lián)系 , 并進(jìn)一步考察了金屬離子對(duì)結(jié)合反應(yīng)的影響。陳曉嵐 , 等 [ 16]在葛根素 7 磷酰二烷基酯的電噴霧質(zhì) 譜研究中嘗試對(duì)葛根 素進(jìn)行了磷?；Y(jié)構(gòu)改造 , 合成了一系列葛根素 272 磷酸二烷基酯衍生物 , 對(duì)其在 ESIM S 中的裂解規(guī)律進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅有助于此類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)分析 , 對(duì)進(jìn)一步研究它們的藥物性質(zhì)以及代謝機(jī)理等具有重要的意義。屈凌波 , 等 [ 15]則利用熒光光譜在激發(fā)波長(zhǎng)處 , 熒光測(cè)定中固定 BSA 的濃度而改變葛根素、 7 磷酰化葛根素衍生物的濃度 , 探討了葛根素、 7 磷?；鸶仵ズ? 7 二異丙基磷酸葛根素酯分別與牛血清蛋白的相互作用。雷軍 ,等 [ 17]選擇葛根素作為先導(dǎo)物 , 通過(guò)與溴代異戊烯在碳酸鉀存在下的 醚化反應(yīng) , 乙?；Ｗo(hù)糖基 , 以 N, N 二乙基苯胺為溶劑加熱的 Claisen重排反應(yīng) , 合成了幾個(gè)新衍生物。 3124位 39。羥基烷基化結(jié)構(gòu)修飾 張首國(guó) , 等 [ 18]葛根素衍生物的合成及抗缺氧活性研究針哈爾濱商業(yè)大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 14 對(duì)葛根素水溶性差的缺點(diǎn) , 在其 4c 位羥基引入烷胺基烷基 , 得到新的葛根素衍生物。通過(guò)小鼠抗缺氧試驗(yàn)和離體動(dòng)脈條試驗(yàn) , 評(píng)價(jià)了目標(biāo)化合物的抗缺氧活性和擴(kuò)血管活性 , 結(jié)果合成了 12 個(gè)新的葛根素衍生物 , 初步藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 , 大多數(shù)化合物的抗缺氧活性等于或略強(qiáng)于葛根素 , 化合物 P P P P5 和 P6 均具有明顯的擴(kuò)血管活性 , 活性隨劑量增加而增大 , 其中 P1和 P2 擴(kuò)血管活性強(qiáng)于葛根素。 3 13 酚羥基和糖 C6 醇 39。39。羥基修飾 藥理研究結(jié)果表明葛根素還具有疏通視網(wǎng)膜栓塞的作用 [ 19], 對(duì)治療視網(wǎng)膜阻塞有較好的療效。葛根素為異黃酮碳苷 , 7, 4c 二羥基為活性基團(tuán) , 其中 7 位羥基因 8 位糖的位阻影響 , 活性較 439。 位羥 基弱。基于此 , 楊若林 , 等 [ 20]用醚化及?；姆椒ㄖ苽淞? 10個(gè)葛根素的衍生物 , 其中 8個(gè)為新化合物。并研究了其對(duì)眼內(nèi)各組織、血管血流量的 影響。 (3)結(jié)構(gòu)修飾的意義 由于大部分藥物的療效是由藥物分子與生物受體分子間的相互作用而產(chǎn)生 , 因此藥物分子的溶解性能及分子的大小、形狀和空間結(jié)構(gòu)都很重要。由此設(shè)想通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾來(lái)改善葛根素的水溶性和脂溶性 , 并改變其空間結(jié)構(gòu) , 從而影響葛根素的藥理活性。 , 立題依據(jù) 隨著 世界經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，全球 各國(guó)普遍面臨 著 人口老齡化加劇的 趨勢(shì) ，老年人的精神衛(wèi)生問(wèn)題 和對(duì) 老齡化疾病的防治 也 日漸成為全球性公共衛(wèi)生 的重要課題。其中癡呆是老年疾病中最常見(jiàn)的病癥，癡呆是指腦功能受損導(dǎo)致的認(rèn)知功能?chē)?yán)重障礙，即學(xué)習(xí)記憶能 力受到損傷。 根據(jù)近些年的研究，我們可以了解到癡呆的發(fā)病率己呈上升趨勢(shì)，在歐美國(guó)家中癡呆多以阿爾茨海默病居多，占全部癡呆病例的 50%，血管性癡呆占 20%，阿爾茨海默病與血管性癡呆的混合型則占 10%~20%。而在亞洲國(guó)家發(fā)病情況正好相反，血管性癡呆占 60%，阿爾茨海默病占 30%，阿爾茨海默病與血管性癡呆的混合型則占10%[34]。而在這其中由于我又國(guó)是一個(gè)血管病多發(fā)的國(guó)家，所以血管性癡呆患者在我國(guó)人群中占有相當(dāng)高的比例 [35]，且隨著我國(guó)人口的老齡化以及人民平均壽命的延長(zhǎng)，血管性癡呆癥的患病率正在呈直線(xiàn)增加。 根據(jù)我國(guó)關(guān)于癡呆的流行病學(xué)調(diào)查表明，血管性癡呆隨年齡的增長(zhǎng)而直線(xiàn)增高，在 60 歲以上的人群中，癡呆的患病率為%~%， 70 至 79 歲的人群患病率為 2%， 80 歲以上為 16%，而 90 歲以上的人群則高達(dá) 68%[36]。癡呆為患病者造成巨大痛苦，為患者家庭生活帶來(lái)重重困難，更是為社會(huì)增加了沉重的負(fù)擔(dān)。 血管性癡呆癥的患病率正隨著人民生活的逐漸富裕及生活飲食的不規(guī)律等多種因素而劇增，所以血管性癡呆癥己成為我們急需密切重視的公共健康問(wèn)題 [37]。在 國(guó)際上 對(duì)血管性 癡呆的發(fā)病機(jī)制 還未有準(zhǔn)確定論 ，而且 并 無(wú) 十分 有效的 治療藥物 ，但 就目哈爾濱商業(yè)大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 15 前而言，中醫(yī)藥在治療癡呆方面 卻 是療效顯著。 我國(guó)又是一個(gè)中藥發(fā)達(dá)的大國(guó)，中草藥資源十分豐富，有民間應(yīng)用的臨床基礎(chǔ)，所以從祖國(guó)中藥寶庫(kù)中挖掘活性強(qiáng)、毒副作用小的防治癡呆的藥物具有廣闊的前景。已有研究表明，葛根素的療效十分廣泛，其藥理作用大多有利于阿爾茲海默病的預(yù)防治療 [38]，但葛根素對(duì)于腦組織缺血缺氧所致的學(xué)習(xí)記憶功能障礙和神經(jīng)損傷是否有改善作用的報(bào)道卻并未多見(jiàn)。因此 本論文 研究葛根素對(duì)反復(fù)腦缺血再灌注致癡呆模型小鼠神經(jīng)保護(hù)作用的影響 ，旨在發(fā)掘 葛根素更為廣泛的作用。 哈爾濱商業(yè)大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 16 2 實(shí)驗(yàn)部分 引 言 學(xué)習(xí)與記憶障礙是腦缺血性損傷的主要癥狀，而腦缺血再灌注損傷是造成血管性癡呆的主要原因之一。大腦 皮層與學(xué)習(xí)記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)密切相關(guān) ，并對(duì)缺血缺氧極其敏感。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模是利用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎造成腦供血供氧不足，從而引發(fā)腦缺血性損傷。 本實(shí)驗(yàn)主要采用小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎再灌注致癡呆模型，運(yùn)用水迷宮實(shí)驗(yàn)方法，并對(duì)小鼠大腦皮層中 SOD 的活力進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)，考察葛根素對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎再灌注致癡呆模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠 60 只，體重 25~30g，雄 性（ 8 周齡）， 由 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)： SCXK（軍） 2021005 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 尼莫地平片 拜耳醫(yī)藥保健有限公司 批號(hào)： 132865 注射用青霉素鈉 哈藥集團(tuán)制藥總廠 氯化鈉注射液 哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司 水合氯醛 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司 純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司 碘伏消毒液 德州安捷高科消毒制品有限公司 葛根素 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院醫(yī)藥基礎(chǔ)教研室 實(shí)驗(yàn)儀器 一次性使用無(wú)菌注射器（帶針） 上?？祲坩t(yī)療器械有限公司 電子 分析天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司 電熱恒溫水浴箱 RF540 型 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠 電動(dòng)低速離心機(jī) LDS2 型 北京醫(yī)用離心機(jī)廠 WXH 微型旋渦混合器 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠 程控 F 型水迷宮 SMG2 醫(yī)科院藥研所制 超氧化物歧化酶試劑盒 SOD 酶法 南京建成生物工程研究所 UV2102C 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司 哈爾濱商業(yè)大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 17 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法 模型 制備 將小鼠以 %水合氯醛腹腔注射麻醉。仰臥固定。消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，以動(dòng)脈夾夾住血管，阻斷 血流 20min，同時(shí)尾部放血 ，熱凝止血，恢復(fù)血流 10min，再次阻斷血流 20min；假手術(shù)組僅暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈不結(jié)扎，尾部不放血。 動(dòng)物分組及 給藥方案 將動(dòng)物隨機(jī)分成 6組（每組各 10只）：假手術(shù)組、模型組、尼莫地平 （ 40mg/kg）組、葛根素低、中、高（ 25mg/kg、 50mg/kg、 100mg/kg）劑量組。 （ 1）模型組：按上述步驟制備模型，術(shù)后 48h 后每 日 灌胃給予蒸餾水； （ 2）假手術(shù)組： 手術(shù)步驟同模型組，但不對(duì)其雙側(cè)血管進(jìn)行結(jié)扎，尾部也不放血。術(shù)后 48h 后每日灌胃給予蒸餾水； （ 3）尼莫地平組： 手術(shù)步驟同模型組， 術(shù)后 48h 后每 日 灌胃給予藥物（尼莫地平 40mg/kg）； （ 4）葛根素給藥組： 手術(shù)步驟同模型組， 術(shù)后 48h 后每 日 灌胃給予藥物（葛根素 2 50、 100mg/kg）。 各組均連續(xù)給藥 7 天后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn) ， 16 天后取材進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)。 水迷宮 水迷宮 裝置 尺寸為 63?36?20cm，由 “ F” 型棕色塑料隔板交錯(cuò)分割成相通的五部分，形成一條曲折的水道 （如下圖 21） ，水深 10cm，水溫 23?1℃ ， S為起始區(qū) ,F為目標(biāo)區(qū)。在 F區(qū)處有一階梯，動(dòng)物到達(dá)階梯 F可以獲得休息。 每 只小鼠每天訓(xùn)練 7次，間隔 30s，共訓(xùn)練 5天 。每次訓(xùn)練 時(shí) 記錄小鼠進(jìn)入水中至到達(dá)安全區(qū)的時(shí)間，計(jì)算每天 小鼠到達(dá)安全區(qū)的平均游泳 時(shí)間。 圖 21 水迷宮示意圖 F S 哈爾濱商業(yè)大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 18 生化檢測(cè) 小鼠行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后， 快速斷頭 取腦，剝離小鼠的大腦皮層 ，放在下置冰塊的表面皿上，用濾紙將表面血吸干 ， 稱(chēng)重， 凍存于 80℃ 備用。進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)時(shí)，以重量 /體積比 1:9 加入 4℃ 生理鹽水，制成 10%的 腦組織 勻漿， 3000r/min 低溫離心15min，取上清液，按 超氧化物歧 化酶（ SOD） 試劑盒說(shuō)明，用 722 分光光度計(jì)測(cè)定大腦 皮層 組織 中 SOD 的 活 力。 （ 1）原理：本試劑盒通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基 (O2)，后者氧化羥胺形成亞酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見(jiàn)光光度計(jì)測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含 SOD 時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專(zhuān)一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度，通過(guò)公式計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的 SOD 活力。 按 SOD 試劑盒要求配制各試劑。操作如下： 試劑 測(cè)定管 對(duì)照管 試劑一 （ ml） 樣品 （ ml） － 蒸餾水 （ ml） 試劑二 （ ml） 試劑三 （ ml） 試劑四 （ ml） 顯色劑 （ ml） 2 2 用微型旋渦混勻器充分混勻，置 37℃恒溫水浴 40 分鐘。 與顯色劑混勻后，室溫放置 10 分鐘，于波長(zhǎng) 550nm 處， 1cm 光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色。 （ 2）定義 :每毫克組織蛋白在 lml 反應(yīng)液中 SOD 抑制率達(dá) 50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的 SOD量為一個(gè)亞硝酸鹽單位。 （ 3）組織勻漿中 SOD 活力計(jì)算公式： SOD 活力 (NU/mgprot)=(對(duì)照管吸光度 測(cè)定管吸光度 )反應(yīng)液的的總體積 /對(duì)照管吸光度 50%取樣量組織中蛋白含量 (mgprot/ml) 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 軟件進(jìn)行 數(shù)據(jù) 處理 ，所有數(shù)據(jù)都 以 均數(shù)177。標(biāo)準(zhǔn)差 表示， 采用單因素方差分析方法 。 若 P＜ 則認(rèn)為 差異 具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 。 哈爾濱商業(yè)大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 19 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 葛根素對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎再灌注致癡呆模型小鼠 水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知 ， 與假手術(shù)組小鼠相比，模型組小鼠 在水迷宮 測(cè)試 期間從起點(diǎn)到安全區(qū)的游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng) （ P， n=10） 。 與模型組小鼠相 比，葛根素各給藥組及尼莫地平組小鼠 劑量依賴(lài)性地縮短到達(dá)安全 區(qū) 的游泳時(shí)間 。 （見(jiàn) 表 21， 圖 22）。 表 21 葛根素對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎再灌注致癡呆模型小鼠 水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響 （ n=10, ?X177。SD） 到達(dá)安全臺(tái)的游泳時(shí)間 (s) 組別 劑量 (mg/kg) 1d 2d 3d 4d 5d 假手術(shù)組 － 177。 177。 177。 177。 177。 模型組 － 177。 177。 177。 177。 177。 葛根素 組 25 177。* 177。 177。 177。 177。 50 177。* 177。 177。 177。 177。 100 177。* 177。* 177。* 177。* 177。* 尼莫地平 組 40 177。* 177。* 177。* 177。* 177。** P，與假手術(shù)組相比； *P， **P，與模型組相比 圖 22 表 21 葛根素對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎再灌注致癡呆模型小鼠 水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響 （ n=10, ?X177。SD） P，與假手術(shù)組相比； *P， **P，與模型組相比 哈爾濱商業(yè)大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 20 葛根素對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎再灌注致癡呆模型小鼠大腦皮層 SOD活力的影響 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與假手術(shù)組小鼠相比，模型組小鼠大腦皮層內(nèi)的 SOD 活力顯著降低（ P， n=10） 。與模型組小鼠相比，葛根素高劑量組（ 100mg/kg）與尼莫地平組小鼠大腦皮層內(nèi)的 SOD 活力顯著升高（ P， n=10）。（見(jiàn) 表 22，圖 23）。 表 22 葛根素對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎再灌注致癡呆模型小鼠大腦皮層 SOD 活力的影響 （ n=10, ?X177。SD） 組別 劑量 (mg/kg) SOD 活力 (U/mgprot) 假手術(shù)組 － 177。 模型組 － 177。 葛根素組 25 177。 50 177。 100 177。 ** 尼莫地平組 40 177。 ** P，與假手術(shù)組相比； **P，與模型組相比 圖 23 葛根素對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎再灌注致癡呆模型小鼠大腦皮層 SOD 活力的影響 （ n=10, ?X177。SD） P，與假手術(shù)組相