western_blot詳解及問(wèn)題分析-資料下載頁(yè)
2025-05-15 01:00本頁(yè)面
【正文】 Western Blot ? 條帶比正常的窄？ ? “ 微笑 ” 或 “ 倒微笑 ”條帶？ ? 凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動(dòng)作輕緩 ? 拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲 ? 樣品鹽濃度過(guò)高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度 ? 膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適 SDSPAGE電泳 Western Blot 轉(zhuǎn)膜及抗體檢測(cè) ? 凝膠腫脹或卷曲？ ? 條帶歪斜或漂移？ ? 單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？ ? 轉(zhuǎn)膜緩沖液過(guò)熱 ？ ? 可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡 510min ? 電轉(zhuǎn)儀長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致。可在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙 ? 確保膜和膠塊之間沒(méi)有氣泡 ? 緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過(guò)程注意降溫 Western Blot 轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白很少 1. 蛋白分子量 10KD 2. 蛋白的等電點(diǎn) 9 3. SDS濃度不合適 4. 凝膠太厚 原因 對(duì) 策 1. 蛋白分子量 10KD時(shí)，減少轉(zhuǎn)膜時(shí)間；使用小孔徑的膜 2. 更換高 pH值 Buffer 3. 在陰極 buffer中加入 % SDS 可提高轉(zhuǎn)膜效率 4. 延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間 Western Blot 1. 膜沒(méi)有均勻浸濕 2. 膜或者緩沖液污染 3. 封閉不充分 4. 抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng) 5. 抗體濃度過(guò)高 原因 對(duì) 策 1. 轉(zhuǎn)膜前用 100%甲醇將膜完全浸濕 2. 拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液 3. 檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng) 4. 雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度 背景太高 Western Blot 雜交信號(hào)很弱 1. 抗體保存不當(dāng) 2. 抗原不充足 3. 膜的漂洗過(guò)度 原因 對(duì) 策 1. 抗體長(zhǎng)期保存應(yīng)在－ 70℃，使用前做效價(jià)檢測(cè) 2. 增加蛋白上樣量，做已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對(duì)照 3. 減少漂洗的時(shí)間和次數(shù) Western Blot 1. 一抗不是唯一特異的 2. 二抗出現(xiàn)非特異結(jié)合 原因 對(duì) 策 1. 制備單克隆抗體或者重新選取合成抗原多肽的位點(diǎn) 2. 設(shè)立不加一抗，只加二抗的平行對(duì)照來(lái)檢測(cè)二抗是否有非特異結(jié)合 出現(xiàn)非特異帶 Western Blot Further Readings ? 生物秀 Western Blotting專(zhuān)題 ? ? Millipore的蛋白印跡手冊(cè) ? ? BioRad的 western Blotting操作手冊(cè) ? ? Western blot問(wèn)題解答專(zhuān)帖 ? 謝謝大家！
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