western-blot實(shí)驗(yàn)方法步驟-資料下載頁
2025-05-11 00:51本頁面
【正文】 ，周圍有背景，是為什么？ 答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上 HRP 催化活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間不長，將周圍底物催化完，形成了空白。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物。 ? 我的膠片是一片空白，是怎么回事？ 如果能能夠排除下面的幾個(gè)問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。 1 二抗的 HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光； 2 ECL底物中 H2O2，不穩(wěn)定，失活； 3 ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置； 4 二抗失活。 ? 問我顯影液顯影 1分鐘 ,和 5分鐘后 ,底片漆黑一片 ,是什么原因呢 ? 1可能是紅燈造成的 ,可以在完全黑暗的情況下操作 .看是否有改善 . 膠片本來就被曝光了 2顯影時(shí)間過長 . 疑難雜證 ? DAB好還是 ECL好？ DAB(二氨基聯(lián)苯胺 ) 有毒 ,但是比較靈敏 ,是 HRP最敏感的底物； ECL結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測 pg 級(jí)抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。 ? 抗原分子量是資料上的兩倍，是怎么回事？ 抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時(shí)間延長，可以打開二聚體。在上層膠中加入尿素至 8M也可以打開。 ? 半干轉(zhuǎn)是否要求膜，濾紙，膠同樣大?。恳?yàn)槟z大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會(huì)大一點(diǎn)，那樣會(huì)不會(huì)短路？什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢？ 一般參照 膜 = 濾紙 膠 , 就行，你轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結(jié)束時(shí)一般是開始的 是正常的。一般 Buffer和濾紙選的對(duì)就不會(huì)短路。 疑難雜證 ? 電泳時(shí) Marker 按說明加 5ul，但電泳中看不見，是失活了嗎？ 加入 20ul即可。 ? 蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時(shí) Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么了？ 可能是 1樣品濃度過低 2轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠。 ? 一抗量較少，同時(shí)不知道一抗的最佳稀釋比例是多少，怎么做呢？ 確定實(shí)驗(yàn)過程無污染后，將含抗體的稀釋液回收，保存于70℃ 。最好第一次的 濃度做高一點(diǎn)，這樣，如果結(jié)果不好，可以嘗試再稀釋。 免疫沉淀法檢測表達(dá)蛋白 ? 可用于檢測并定量分析多種蛋白質(zhì)復(fù)合物中的靶抗原。 ? 很敏感，可檢測出 100pg的放射性標(biāo)記蛋白。 ? 當(dāng)與 SDSPAGE并用時(shí)，即可用于分析外源基因在原核和真核宿主細(xì)胞中的表達(dá)情況。 操作步驟 ? 靶蛋白的放射性標(biāo)記 ? 裂解細(xì)胞 ? 特異性免疫復(fù)合物的形成 ? 免疫復(fù)合物的收集和純化 ? 放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)的免疫沉淀分析 靶蛋白的放射性標(biāo)記 ? 同位素通常是 35S，其半衰期為 ，同位素是以 35S－標(biāo)記蛋氨酸或 35S－蛋氨酸和半胱氨酸。 ? 這些氨基酸是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的必須氨基酸，必須由培養(yǎng)基中提供。 ? 培養(yǎng)基中含有高濃度的蛋氨酸和半胱氨酸，為了增加同位素標(biāo)記氨基酸的滲入率，可去除培養(yǎng)基中的蛋氨酸或同時(shí)去除蛋氨酸和半胱氨酸。 ? 同位素標(biāo)記的強(qiáng)度取決于被檢蛋白的合成速度和其氨基酸的組成，以及該蛋白質(zhì)的代謝速度。 免疫復(fù)合物的收集和純化 ? 用耦聯(lián)葡萄球菌蛋白 A和 Sepharose進(jìn)行吸附：結(jié)果清晰，但成本高，并且所需抗體有種系特異性的限制。 ? 用經(jīng)熱致死并經(jīng)甲醛固定的 附：背景高，但是經(jīng)濟(jì)。 ? 用抗被檢蛋白抗體的抗體進(jìn)行吸附，這種方法用于下列兩種情況： 1第一抗體的 FC不能被葡萄球菌蛋白質(zhì) A識(shí)別； 2對(duì)被檢蛋白進(jìn)行定量分析時(shí)。
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