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2025-05-11 00:51本頁面
【正文】 ，周圍有背景，是為什么？ 答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上 HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物。 ? 我的膠片是一片空白，是怎么回事？ 如果能能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。 1 二抗的 HRP 活性太強，將底物消耗光； 2 ECL底物中 H2O2，不穩(wěn)定，失活； 3 ECL底物沒覆蓋到相應位置； 4 二抗失活。 ? 問我顯影液顯影 1分鐘 ,和 5分鐘后 ,底片漆黑一片 ,是什么原因呢 ? 1可能是紅燈造成的 ,可以在完全黑暗的情況下操作 .看是否有改善 . 膠片本來就被曝光了 2顯影時間過長 . 疑難雜證 ? DAB好還是 ECL好？ DAB(二氨基聯(lián)苯胺 ) 有毒 ,但是比較靈敏 ,是 HRP最敏感的底物； ECL結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測 pg 級抗原。要看你實驗的情況。 ? 抗原分子量是資料上的兩倍，是怎么回事？ 抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。在上層膠中加入尿素至 8M也可以打開。 ? 半干轉是否要求膜，濾紙，膠同樣大小？因為膠大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會大一點，那樣會不會短路？什么是短路？如何控制和發(fā)現短路呢？ 一般參照 膜 = 濾紙 膠 , 就行，你轉移前和轉移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結束時一般是開始的 是正常的。一般 Buffer和濾紙選的對就不會短路。 疑難雜證 ? 電泳時 Marker 按說明加 5ul，但電泳中看不見，是失活了嗎？ 加入 20ul即可。 ? 蛋白轉移不到膜上，但膠上有，同時 Marker 轉上去了，為什么了？ 可能是 1樣品濃度過低 2轉移時間不夠。 ? 一抗量較少，同時不知道一抗的最佳稀釋比例是多少，怎么做呢？ 確定實驗過程無污染后，將含抗體的稀釋液回收，保存于70℃ 。最好第一次的 濃度做高一點，這樣，如果結果不好，可以嘗試再稀釋。 免疫沉淀法檢測表達蛋白 ? 可用于檢測并定量分析多種蛋白質復合物中的靶抗原。 ? 很敏感，可檢測出 100pg的放射性標記蛋白。 ? 當與 SDSPAGE并用時，即可用于分析外源基因在原核和真核宿主細胞中的表達情況。 操作步驟 ? 靶蛋白的放射性標記 ? 裂解細胞 ? 特異性免疫復合物的形成 ? 免疫復合物的收集和純化 ? 放射性標記蛋白質的免疫沉淀分析 靶蛋白的放射性標記 ? 同位素通常是 35S，其半衰期為 ，同位素是以 35S－標記蛋氨酸或 35S－蛋氨酸和半胱氨酸。 ? 這些氨基酸是哺乳動物細胞的必須氨基酸，必須由培養(yǎng)基中提供。 ? 培養(yǎng)基中含有高濃度的蛋氨酸和半胱氨酸，為了增加同位素標記氨基酸的滲入率，可去除培養(yǎng)基中的蛋氨酸或同時去除蛋氨酸和半胱氨酸。 ? 同位素標記的強度取決于被檢蛋白的合成速度和其氨基酸的組成，以及該蛋白質的代謝速度。 免疫復合物的收集和純化 ? 用耦聯(lián)葡萄球菌蛋白 A和 Sepharose進行吸附：結果清晰，但成本高，并且所需抗體有種系特異性的限制。 ? 用經熱致死并經甲醛固定的 附：背景高，但是經濟。 ? 用抗被檢蛋白抗體的抗體進行吸附，這種方法用于下列兩種情況： 1第一抗體的 FC不能被葡萄球菌蛋白質 A識別； 2對被檢蛋白進行定量分析時。
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