【導(dǎo)讀】生組織保健資源和世界經(jīng)濟(jì)影響非常巨大。因此，研制具有良好免疫保護(hù)作用的預(yù)防性。和治療性疫苗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。病毒感染過程中能夠介導(dǎo)病毒脂膜與細(xì)胞膜的融合。因此，gp41已成為抗HIV理想的藥。本研究利用分子生物學(xué)、免疫學(xué)等實(shí)驗(yàn)。技術(shù)和手段進(jìn)行了HIV-1跨膜蛋白gp41核酸疫苗的構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)性免疫學(xué)研究。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)，酶切鑒定正確后，將其轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，結(jié)果表明能成功表達(dá)了gp41蛋白。小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示其具有良好的免疫原性，既可。刺激小鼠產(chǎn)生體液免疫，同時又可以刺激小鼠產(chǎn)生細(xì)胞免疫。疫苗甚至進(jìn)一步進(jìn)入臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

　　

【正文】 各孔的 OD值，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 與分析 1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 挑取培養(yǎng)板上陽性菌落，接種于含 25μ g/ml 氨芐青霉素 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 16h 以上。用堿裂解的方法提取質(zhì)粒， 用 EcoR I 酶切下兩條帶（ 1122bp、 5300bp） 。酶切結(jié)果（圖3）與預(yù)計(jì)的相 符，說明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確。 圖 3 pIRES gp41 酶切鑒定 Fig4. Identification of pIRES gp41 by EcoR I digestion lane1: pIRES gp41plasmid. 2: pIRES gp41/EcoR I 3: DNA marker (DL2 000) 4: DNA marker λEcoT14I digest 2 gp41 基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測 間接免疫熒光檢測顯示，轉(zhuǎn)染重組核酸疫苗質(zhì)粒 pIRESgp41 的 BHK21 細(xì)胞，在核周圍及細(xì)胞漿中出現(xiàn)與特異性熒光抗體發(fā)生反應(yīng)的黃綠色熒光（如圖 A），而對照組質(zhì)粒 pIRES 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未見黃綠色熒光（如圖 B）。結(jié)果說明，所構(gòu)建的重組核酸疫苗 20 質(zhì)粒能在真核細(xì)胞中表達(dá) gp41 蛋白 。 3 ELISA 方法檢測 HIV 特異性抗體 將酶標(biāo)儀測得的 OD450進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在不同時間點(diǎn) 采樣對小鼠血清進(jìn)行抗體檢測，由表 2 可知 pIRESgp41 免疫組從第一周開始就可檢測到微弱的抗體反應(yīng)。第二次加強(qiáng)免疫后，抗體水平明顯升高，至第三次免疫后達(dá)到最高水平。在整個測定過程中pIRES 對照免疫組只出現(xiàn)很微弱的非特異性反應(yīng)。 表明構(gòu)建的核酸疫苗可以有效的誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗 HIV的抗體。 表 2 免疫小鼠 ELISA 抗體水平檢測結(jié)果 Table2. The detection of antiHIV in serum by ELISA from immunized mice Groupe immunized 0 week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week pIRESgp41 177。 177。 177。 177。 177。 177。 pIRES 177。 177。 177。 177。 177。 177。 B 圖 4 核酸疫苗質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 BHK 細(xì)胞的熒光圖片 Fig4 . Fluorescent photos of BHK21 cells transfected by rebinant plasmid A. HIV rebinant plasmid。 B. control plasmid A B 21 免疫小鼠ELISA抗體水平檢測結(jié)果00 1 2 3 4 5weekOD值PIRESgp41PIRES 圖 5 pIRES 及 pIRESgp41 免疫鼠血清中 HIV1 抗體的檢測 Figure5. Dynamics of HIV specific serumm IgG antibodies in mice immunized with pIRES and pIRESgp41 4 T 淋巴細(xì)胞亞類數(shù)量的檢測 通過流式細(xì)胞儀（ FACS）檢測 10000 個小鼠脾細(xì)胞中的 CD3+CD4+、 CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞個數(shù)為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見表 3。 結(jié)果表明，重組質(zhì)粒 pIRESgp41 免疫組的 的淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著高于空載體質(zhì)粒pIRES 對照組（ p），表明重組質(zhì)粒免疫小 鼠后表達(dá)了外源蛋白，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了 T淋巴細(xì)胞亞類的增殖反應(yīng)，此外其比值穩(wěn)定在 ～ 之間，表明小鼠對重組疫苗沒有不良的免疫反應(yīng)。 圖 6 pIRES及 pIRESgp41免疫鼠脾 CD4+、 CD8+細(xì)胞亞群數(shù)量的變化 Figure6. Dynamics of CD4+、 CD8+cell in spleen of immunized with pIRES and pIRESgp41 重組核酸疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞T淋巴細(xì)胞亞類的數(shù)量（%）05101520253035CD4+ CD3+ CD8+ CD3+ CD4+ CD3+/ CD8+CD3+處理OD值PIRESgp41PIRES 22 表 3 重組核酸疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞 T 淋巴細(xì)胞亞類的數(shù)量（ %） Table 3 The number of spleen T lymphocyte subgroups of mice immunized by rebinant nucleic vaccine groupe CD4+ CD3+ CD8+ CD3+ CD4+ CD3+/ CD8+ CD3+ PIRESgp41 177。 177。 PIRES 177。 177。 討 論 1 HIV1gp41跨膜蛋白受到廣泛關(guān)注 HIV1的主要免疫原 是包膜蛋白 gp120和跨膜蛋白 gp41，由于 gp120是外膜蛋白，人們曾經(jīng)將注意力放在研制以 gp120為靶點(diǎn)的疫苗 [27]。但實(shí)踐證明大多數(shù) HIV1感染或接種誘生的抗 gp120抗體都不能中和病毒或者滴度很低 [28]。 gp120還可以誘導(dǎo)自身免疫應(yīng)答，并且產(chǎn)生加重 HIV1的感染和疾病進(jìn)程的抗體 [29],此外 gp120具有高度變異性， 不同毒株 HIVgp120有明顯差別， 不同的 HIV1亞型在編碼包膜蛋白的 env基因的高度變異致使其包膜蛋白氨基酸序列改變，從而導(dǎo)致病毒對免疫攻擊的敏感性改變使其能逃脫免疫系統(tǒng) 的監(jiān)視。 Henderson等人根據(jù)對百余種不同株型的 HIV1gp120的一級結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，它的 V3環(huán) 36個氨基酸殘基中，只有在環(huán)基底部的 2個半胱氨酸的殘基及附近的氨基酸殘基和頂部的 GPG保持不變，其它部分則變異很大。有研究表明不同地區(qū)分離得到 HIV1毒株間的 gp120蛋白氨基酸序列有 20%以上的變異率，不同亞型遺傳及血清學(xué)上反應(yīng)存在明顯差異 [30]。由于 gp120的諸多缺點(diǎn)，今年來以 gp41為靶點(diǎn)的新藥研發(fā)和疫苗設(shè)計(jì)受到關(guān)注 [31， 32]， gp41在結(jié)構(gòu)上相對保守，在 HIV1的診斷上具有相當(dāng)重要的 意義。 gp41的包外區(qū)由兩個包含 a螺旋的疏水重復(fù)序列構(gòu)成，即位于 N末端的融合肽 NHR和 C末端的 CHR、 NHR和 CHR的結(jié)合導(dǎo)致了病毒的融膜 [33]，本研究就是以結(jié)構(gòu)上相對保守的 gp41為耙點(diǎn)進(jìn)行了重組核酸疫苗的構(gòu)建。 2 艾滋病疫苗研發(fā)具有很大的不確定性 艾滋病疫苗研發(fā)的最主要技術(shù)難點(diǎn)在于艾滋病病毒不同于其他病毒， 很容易產(chǎn)生變異，以躲避免疫攻擊；此外，國際經(jīng)驗(yàn)表明，疫苗研究是相當(dāng)依靠經(jīng)驗(yàn)的，艾滋病疫苗研發(fā)具有很大的不確定性 [34]。 HIV的高度變異是 HIV在免疫和藥物選擇壓力下賴以生存的基礎(chǔ)，此外， 高幾率的基因重組使得大多數(shù)適宜的突變混合匹配，從而逃避宿 23 主的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，病毒對宿主最低程度的適應(yīng)也從個體的逃避突變中產(chǎn)生。突變、重組所致 HIV多樣性產(chǎn)生的機(jī)制依賴于病毒進(jìn)行著的活躍復(fù)制，產(chǎn)生的大量突變病毒在宿主免疫應(yīng)答的選擇下出現(xiàn)抵抗株，也是病毒難以清除地主要原因和疫苗研制的主要障礙 [35]。 HIV的迅速傳播和擴(kuò)散，其主要原因是病毒的高度變異和多樣性，全面并深入了解 HIV1基因變異和分子進(jìn)化及其相互關(guān)系有關(guān)方面的最新進(jìn)展，將有助于我們更好理解基因變異和進(jìn)化在 HIV1感染傳播和致病性的影響作用， 并給藥物和疫苗研究提供新的思路，也為艾滋病的預(yù)防和治療尋找科學(xué)依據(jù)。 如果變異的病毒能夠更好地自我復(fù)制并存活于體內(nèi)，這些變異病毒就會有機(jī)會傳播給其他人，從而擴(kuò)大其種系生存空間，病毒得以進(jìn)化。進(jìn)化多樣的艾滋病毒形成了一個互不相同，又相互關(guān)聯(lián)的種系，在這種種系內(nèi)，根據(jù)其遺傳基因的相關(guān)性又可以將艾滋病毒分為多個 “ 族群 ” ，亦稱為亞型。每個亞型的基因物質(zhì)與其它亞型約有 30%的差異?？茖W(xué)家們給每個亞型以字母命名。有些病毒可能是兩個亞型的合成體，被稱為 “ 重組 ” 形式。亞型 C在南非、埃塞俄比亞、中國和印度較常見，亞型 B在美國、 歐洲、加勒比和南美洲最常見。然而病毒亞型的分布是動態(tài)的。比如，在東非最常見的亞型 A，現(xiàn)在開始在烏克蘭和東歐部分地區(qū)大量傳播；在泰國的重組亞型（ A/E），在我國云南也有發(fā)現(xiàn)。 早期研制的疫苗，多數(shù)是針對亞型 B開發(fā)的。然而，許多正在研發(fā)和試驗(yàn)的疫苗是針對其它現(xiàn)存的亞型。但是，針對一種亞型的候選疫苗所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)是否對其它亞型也有效，候選疫苗的研發(fā)是否有必要針對可能測試該候選疫苗的地區(qū)或國家里最常見的病毒亞型，目前尚無明確答案。一種理想的預(yù)防性艾滋病毒疫苗應(yīng)該對所有病毒亞型有預(yù)防作用。如何研制一種具有光譜有效疫 苗或疫苗合成物，是所有艾滋病毒疫苗研究人員所面臨的最大挑戰(zhàn)。 同一個體內(nèi)艾滋病毒也具有多樣性。艾滋病毒不僅僅在不同地區(qū)、不同個體之間存在差異，即使在同一個體內(nèi)也不相同。這就使免疫系統(tǒng)很難對機(jī)體內(nèi)所有的艾滋病毒產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)可能對多數(shù)不同的病毒有效，但仍有一些其它的病毒可能 “ 逃逸 ” 免疫反應(yīng)。同樣地，感染者體內(nèi)病毒可能因變異而產(chǎn)生耐藥性。研究人員們并不清楚艾滋病毒疫苗是否對感染者體內(nèi)不同的病毒有預(yù)防作用。 所以選擇相對保守的 gp41作為靶點(diǎn)具有很重要的意義。 3 核酸疫苗是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn) 目前 國際上多采用高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒 ( HAART)治療艾滋病 (AIDS)， HAART 可在短期內(nèi)將病毒載量控制在很低的水平，但不能完全清除，且 HAART 費(fèi)用昂貴、有一定的不良反應(yīng)、易耐藥。因此消除 AIDS 的根本措施是研制疫苗， HIV疫苗是預(yù)防艾滋病流 24 行一條有效的途徑 [36] 。由于傳統(tǒng)的疫苗在安全性等方面的弊端，目前核酸疫苗 (包括活載體疫苗 )的研究受到廣泛的重視，其最大的優(yōu)點(diǎn)是疫苗抗原可能在靶細(xì)胞內(nèi)以天然的方式合成、加工并呈遞給免疫系統(tǒng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫 [37] 。 核酸疫苗 （ nucleic acid vaccine）又稱基因疫苗（ gene vaccine），包括 DNA疫苗（ DNA vaccine）和 RNA疫苗（ RNA vaccine），是指把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組的質(zhì)粒 DNA直接注射到動物體內(nèi)，使外源基因通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)。 1996年世界衛(wèi)生組織（ WHO）在日內(nèi)瓦召開國際會議，將其統(tǒng)一命名為核酸疫苗（ nucleic acid vaccine）。核酸疫苗開辟了疫苗學(xué)的新紀(jì)元，與常規(guī)疫苗相比具有顯著的優(yōu)點(diǎn)：易于構(gòu)建與改造；成本低廉，適于規(guī)?；a(chǎn)；有良好的熱穩(wěn)定性；以自然抗原形式激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生有效的中和抗體和細(xì)胞毒 T淋巴細(xì)胞反應(yīng) CTL（ cytotoxic T cell）反應(yīng)；核酸疫苗選擇性編碼病原體基因的一部分而不是全部，不會使免疫宿主具有受感染的風(fēng)險。 核酸疫苗引起細(xì)胞免疫 [38]和體液免疫 [39]反應(yīng)，而且誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是細(xì)胞毒 T淋巴細(xì)胞 (CTL)反應(yīng)，被認(rèn)為在病毒、胞內(nèi)菌、寄生蟲等病原體感染的防治中具有更大的優(yōu)勢。 質(zhì)粒 DNA進(jìn)入細(xì)胞核表達(dá)外源蛋白，能進(jìn)行正確的翻譯后加工并保持天然構(gòu)像，在誘發(fā)細(xì)胞免疫方 面具有顯著的優(yōu)勢，并且在體液免疫反應(yīng)方面具有特殊優(yōu)勢。 Bower等使用質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)表達(dá)三聚體形式的 env YU2，可誘發(fā)較高滴度針對構(gòu)像表位的中和抗體，能同時中和 HIV1YU2和 HIV1 ADA的體外感染 [40]。 核酸疫苗作為近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新的生物技術(shù)，已經(jīng)成為疫苗研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，并獲得了迅速的發(fā)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，核酸疫苗既可作為病毒、細(xì)菌或寄生蟲的預(yù)防疫苗，也可作為非感染性疾病如腫瘤病的治療用疫苗。通過介紹近年來核酸疫苗在病毒、細(xì)菌、寄生蟲等感染性疾病的預(yù)防和治療等領(lǐng)域的研究進(jìn)展情況， 表明隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，核酸疫苗的進(jìn)一步研究和實(shí)踐為改善人類和動物健康顯示出新的希望。 核酸疫苗是繼病原體疫苗，亞單位疫苗之后的第三代疫苗，已經(jīng)成為國際疫苗學(xué)及生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，其研究范圍越來越廣，研究程度也日漸深入。 目前，在核酸疫苗發(fā)展的短短幾年時間里，已經(jīng)在病毒、細(xì)菌、寄生蟲等感染性疾病的預(yù)防和治療等領(lǐng)域開展了廣泛和深入的研究 [41]，針對 HIV、 HDNA疫苗研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并可望最先研制成功。 現(xiàn)代免疫學(xué)和病毒學(xué)研究證實(shí)，對于病毒性感染疾病而言，機(jī)體起防御作用的主要是細(xì)胞免疫， DNA疫苗在誘導(dǎo) CTL應(yīng)答方面具有顯著優(yōu)勢，其理論依據(jù)是以任何方式接種 DNA疫苗，都可能直接轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞等 APC細(xì)胞，并在其內(nèi)表達(dá)特定 25 的蛋白抗原作為“內(nèi)源性抗原”，被加工處理轉(zhuǎn)運(yùn)后與 MHC1類分子形成復(fù)合物表達(dá)于APC膜表面，被 CD8+ T細(xì)胞受體識別。 質(zhì)粒免疫的主要特性是能夠誘導(dǎo)