【正文】 間）。 （ 6） 37℃振蕩培養(yǎng) 40～ 60 min（時間不宜過長，轉速不宜過高，主要作用使細菌復蘇）。 4℃， 5000r/min 離心 5~15min。 2 實驗方法 基礎實驗操作方法 感受態(tài)細胞的制備 （ 1） DH5α， JM109 菌液（無質粒）用 50%甘油保存于 70℃，取出解凍后，吸取 200μ l 菌液，在 Amp瓊脂平板表面涂勻， 37℃培養(yǎng) 12h（過夜）。H 2O ，加蒸餾水定容至 100 ml，高壓蒸汽滅菌 20 min。 （ 7）溶液Ⅰ ：葡萄糖 ， 1 mol/L TrisHC1 ml， mol/L EDTA 2 ml，調(diào) pH ，加蒸餾水定容至 100 ml，高壓蒸汽滅菌 15 min。 。 10 國內(nèi)外現(xiàn)在已投入了大量的資金和人力對艾滋病疫苗以及艾滋病病毒的分子生物學和免疫學進行研究，希望能早日遏止艾滋病在世界范圍內(nèi)尤其是發(fā)展中國家不斷加速的蔓延趨勢。此外，將 ER 靶向信號引導序列及非 MHC 限制的通用性 panDR Th細胞表位引入設計的疫苗抗原中，從而能夠獲得最佳的免疫 [23， 24]。 機體的免疫應答包括體液免疫應答和細胞免疫應答 [17， 18]。 （ 3） DNA 疫苗 HIV 變異率很高，是疫苗研究的極 大障礙。目前研究的新型疫苗有以下幾種： （ 1） 亞單位疫苗 包括純化的病毒蛋白和重組的病毒蛋白，后者是將編碼病原體的抗原蛋白基因與質粒拼接后插入細胞宿主，由宿主產(chǎn)生具有抗原活性的蛋白，經(jīng)抽提純化后成為基因工程亞單位疫苗，也稱重組亞單位疫苗。 雖然接種 滅活 疫苗的動物可以不發(fā)展成艾滋病，但是并不能保護接種動物免受野生型病毒的再感染。 HIV感染后一般先出現(xiàn) CD4+ T 淋巴細胞輕度至中度降低，該細胞總數(shù)可持續(xù)數(shù)年不變，反應病毒被免疫應答所抑制，歷經(jīng)一段時間， CD4+ T 進行性減少，當病毒逃脫免疫抑制時可導致機會性感染和腫瘤的出現(xiàn)，以 CD4+ T 淋巴細胞數(shù)量及功能的進一步下降為特征 [11]， 當減少到一定程度，就會出現(xiàn)機會性感染。病毒 DNA 序列被感染細胞及其子代細胞終身攜帶。 HIV 感染者可產(chǎn)生 T 淋巴細胞的細胞毒作用，如在感染腦部發(fā)現(xiàn)有 T 淋巴細胞浸潤，說明 T 淋巴細胞在 HIV感染中發(fā)揮抑制病毒復制的作用 [8]。 （ 9） Vpr 基因編碼蛋白是一種弱的轉錄激活物，在體內(nèi)繁殖周期中起一定作用。實驗表明 gp41 有較強抗原性，能誘導產(chǎn)生抗體反應。 HIV1 還有 2個調(diào)節(jié)基因 tat、 rev 和 4 個附屬基因 nef、 vif、 vpr 和 vpu，分別編碼相應的蛋白 [5]。HIV1和 HIV2基因 變異率很高 ，它們的分離株彼此都不相同，這是由于病毒基因的突變、插入、缺失和不同病毒株之間的基因重組引起的。這些突起由外膜 gp120 蛋白和跨膜 gp41 蛋白 組成，外膜蛋白 gp120 的球狀物突出于病毒包膜之外，另一端貫穿病毒包膜與運轉蛋白 gp41 相接。 艾滋病在以驚人的速度蔓延著，現(xiàn)在每天有 16000人感染上艾滋病，也就 是說平均 5～ 6s 就有 1人感染艾滋病 [4]。從而使病毒在經(jīng)歷數(shù)代繁殖后適應了人體的環(huán)境。 關鍵詞 ： HIV；核酸疫苗； gp41； pIRES；轉染；表達 3 前 言 人免疫缺陷病毒 （ human immunodeficiency virus, HIV） 是引起獲得性免疫缺陷綜合癥 （ AIDS，即艾滋?。?的病原 體。因此，研制具有良好免疫保護作用的預防性和治療性疫苗具有重要的現(xiàn)實意義。 基本實驗操作方法 ................................................................... 錯誤 !未定義書簽。山西農(nóng)業(yè)大學 碩士研究生畢業(yè)論文 HIV1 跨膜蛋白 gp41 核酸疫苗的 構建及其免疫原性研究 研究生姓名 ： 辛 蘇 文 立峰 導 師 ： 馬 海 利 任家 教 授 金 寧 一 研究員 學 科 重組質粒的構建 ....................................................................... 錯誤 !未定義書簽。 gp41 是鑲嵌于 HIV1 脂質雙層中的一種跨膜蛋白 , 是 HIV1 的主要免疫原之一， 在病毒感染過程中能夠介導病毒脂膜與細胞膜的融合。 艾滋病自 1981 年首次發(fā)現(xiàn)以來一直以驚人的速度在全球蔓延 ， 至今人類仍然沒有找 到治療艾滋病的有效方法 。今天，該病在非洲成為了頭號殺手，在世界上則被列為第四大致死性疾病。 進入 90 年代后，亞洲已 成為疾病傳播最快的地區(qū)之一，目前全球四分之一的新增病例出現(xiàn)在亞洲 ， 亞洲目前正處于控制艾滋病蔓延的關鍵時刻。 HIV 病毒的內(nèi)層為蛋白質 (結構蛋白 )， 內(nèi)核也由結構蛋白組成。這兩型病毒都引起相同的臨床癥狀，但 HIV2 的致病力較低。 5 （ 1） gag 基因能編碼約 500 個氨基酸組成的聚合前體蛋白（ P55），經(jīng)蛋白酶水解形成P1 P24 核蛋白，使 RNA 不受外界核酸酶破壞。 （ 4） TaT 基因編碼蛋白（ P14）可與 LTR 結合，以增加病毒所有基因轉錄率，也能在轉錄 后促進病毒 mRNA 的翻譯。 HIV2 基因結構與 HIV1 有差別：它不含 VPU 基因，但有一功能不明 的 VPX基因。 機體產(chǎn)生的抗體可以中和游離 HIV 病毒及已和細胞結合而未進入細胞內(nèi)的 HIV 顆粒。 7 HIV 進入人體后能選擇性的侵犯有 CD4+受體的淋巴細胞，以 CD4+ T 淋巴細胞為主。 5 HIV 藥物和疫苗的研究現(xiàn)狀 20xx 年全球艾滋病感染人口總數(shù)達歷史最高，艾滋病疫苗和藥物的研發(fā)無疑具有極其重要的意義 [11]。并且該疫苗在安全性上存在問題， 由于殘留的 HIV核酸可能具有感染性，作為免疫原接種于人，危險性很大。常用的細胞宿主為大腸桿菌、酵母及哺乳動物細胞。 DNA 疫苗的優(yōu)點是可以對變異迅速的病原微生物提供交叉防御的作用，有助于克服由于病毒的變異而逃避免疫反應的問題。體液免疫主要通過 B細胞產(chǎn)生抗體發(fā)揮效應，而細胞免疫應答包括 CD8+細 胞毒性 T淋巴細胞應答和 CD4+輔助性 T細胞應答， CD4+輔助性細胞又分為 Th1和 Th2亞群。 抗原表位疫苗，尤其是多抗原表位疫苗可能協(xié)助研制有效的疫苗，用于誘導或阻止免疫治療 HIV1 突變的高水平多中和抗體。本研究在前期研究工作的基礎上，通過大量的查新， 構建 了表達病毒跨膜 蛋白 gp41 的核酸疫苗，并對其進行了實驗性免疫研究，為進一步研究抗 HIV1 病毒的 DNA疫苗提供可借鑒的技術數(shù)據(jù)。 （ 2） 1 mol/L Tris： Tris ，加蒸餾水定容至 1000 ml。 （ 8） 溶液Ⅱ ：根據(jù)實驗需要現(xiàn)用現(xiàn)配，取適量體積 2 mol/L NaOH 與 10% SDS 混合后進行 10倍稀釋，使其終濃度分別為 mol/L NaOH 與 1% SDS。 （ 13）堿性磷酸酶緩沖液： 100 mmol/L NaCl， 5mmol/L MgCl2， 100 mmol/L Tris （ 2） 用牙簽挑取單個菌落，接種于 3ml Amp LB 液體培養(yǎng)基中， 37℃，振蕩培養(yǎng)過夜（ 250tpm） 。 （ 7） 棄上清，菌體重懸于 2mL 含 15%甘油的 Tris CaCl2液中。 （ 7） 4000r/min 離心 1 min，倒掉大部分上清液，將其作為菌液（約 50～ 100μ l）涂于LB（ Amp+）平板上（每 1ml培養(yǎng)液加 1μ L 50μ g/ml Amp，實際操作中加 2體積的） Amp。 （ 7） 4℃， 10000～ 120xx r/min， 離心 10 min。（此步應設無菌對照，同時可取少量作為菌種保存） （ 2）以 1%接種于 200ml 高壓 LB 培養(yǎng)液中， 37℃振蕩培養(yǎng) 12～ 18h， OD600＝ 左右時（約 12h），倒入 250ml 離心管中，置冰上 10 min（此步亦可留取菌液作種用）。（溶液Ⅰ∶Ⅱ∶Ⅲ =1∶ 2∶ ） （ 8） 4℃， 7000 r/min，離心 10～ 15min。（如果采用異丙醇沉淀，則室溫放置 30min， 120xx r/min，離心 10～ 15min） （ 3）棄上清，用 70%乙醇洗二次，干燥（可放置 37℃溫箱中干燥 30 min 左右）。 （ 11）棄上清，室溫干燥或真空抽干。將 的質粒 DNA與適量水混勻，使其總體積為 20181。在紫外燈下觀察記錄結果， 并 拍照保存。 56℃ 水浴 10 min，直至膠完全融化 ，其間漩渦振蕩三次，瓊脂糖必須完全融化。以 500181。l，混勻后加入 T4DNA連接酶 ，最后加水至總體積 10181。然后進行質粒的大量提取與純化（見基礎操作部分），使之達到一定濃度， 用來免疫實驗動物。與在室溫下作用 15～ 30min 的轉染試劑和重組質粒的混合物共轉染。l 無血清 MEM，加入 10181。 PBS 洗滌3次，與 HIV1陽性血清（ 1:300）反應 ， PBS 洗滌 3 次，然后與異硫氰酸熒光素（ FITC）標記的羊抗 人 IgG 反應 2h。無菌取其脾臟檢測 T淋巴亞群的數(shù)量。每孔加 入酶聯(lián)試劑 100ul， 37?C 溫育 30min，甩干孔內(nèi)液體 ,用洗滌液充分洗滌 5遍 ,甩干。 3 ELISA 方法檢測 HIV 特異性抗體 將酶標儀測得的 OD450進行統(tǒng)計學分析，在不同時間點 采樣對小鼠血清進行抗體檢測，由表 2 可知 pIRESgp41 免疫組從第一周開始就可檢測到微弱的抗體反應。 177。 B 圖 4 核酸疫苗質粒轉染 BHK 細胞的熒光圖片 Fig4 . Fluorescent photos of BHK21 cells transfected by rebinant plasmid A. HIV rebinant plasmid。但實踐證明大多數(shù) HIV1感染或接種誘生的抗 gp120抗體都不能中和病毒或者滴度很低 [28]。突變、重組所致 HIV多樣性產(chǎn)生的機制依賴于病毒進行著的活躍復制，產(chǎn)生的大量突變病毒在宿主免疫應答的選擇下出現(xiàn)抵抗株，也是病毒難以清除地主要原因和疫苗研制的主要障礙 [35]。然而病毒亞型的分布是動態(tài)的。艾滋病毒不僅僅在不同地區(qū)、不同個體之間存在差異，即使在同一個體內(nèi)也不相同。由于傳統(tǒng)的疫苗在安全性等方面的弊端，目前核酸疫苗 (包括活載體疫苗 )的研究受到廣泛的重視，其最大的優(yōu)點是疫苗抗原可能在靶細胞內(nèi)以天然的方式合成、加工并呈遞給免疫系統(tǒng)，刺激機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫 [37] 。實驗結果表明，核酸疫苗既可作為病毒、細菌或寄生蟲的預防疫苗，也可作為非感染性疾病如腫瘤病的治療用疫苗。 核酸疫苗是繼病原體疫苗，亞單位疫苗之后的第三代疫苗，已經(jīng)成為國際疫苗學及生物學研究領域的熱點，其研究范圍越來越廣，研究程度也日漸深入。 1996年世界衛(wèi)生組織（ WHO）在日內(nèi)瓦召開國際會議，將其統(tǒng)一命名為核酸疫苗（ nucleic acid vaccine）。免疫反應可能對多數(shù)不同的病毒有效，但仍有一些其它的病毒可能 “ 逃逸 ” 免疫反應。 早期研制的疫苗，多數(shù)是針對亞型 B開發(fā)的。 如果變異的病毒能夠更好地自我復制并存活于體內(nèi)，這些變異病毒就會有機會傳播給其他人，從而擴大其種系生存空間，病毒得以進化。 Henderson等人根據(jù)對百余種不同株型的 HIV1gp120的一級結構的分析發(fā)現(xiàn)，它的 V3環(huán) 36個氨基酸殘基中，只有在環(huán)基底部的 2個半胱氨酸的殘基及附近的氨基酸殘基和頂部的 GPG保持不變，其它部分則變異很大。 結果表明，重組質粒 pIRESgp41 免疫組的 的淋巴細胞百分數(shù)顯著高于空載體質粒pIRES 對照組（ p），表明重組質粒免疫小 鼠后表達了外源蛋白，誘導小鼠產(chǎn)生了 T淋巴細胞亞類的增殖反應，此外其比值穩(wěn)定在 ～ 之間，表明小鼠對重組疫苗沒有不良的免疫反應。 pIRES 177。在整個測定過程中pIRES 對照免疫組只出現(xiàn)很微弱的非特異性反應。最后每孔加入終止液 50ul，輕輕震蕩混勻，設定酶標儀波長為 450nm，測定各孔的 OD值，所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。將沉淀重懸于 4ml 紅細胞裂解液中，室溫靜止 10min，離心后再用 Hank’ s 液重懸細胞，洗細胞，重懸于含有10%NBS 的 RPMI1640 培養(yǎng)液中，計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)至 2 107個 /ml，備用。 核酸疫苗免疫小鼠 BALB/c 雌性小鼠 20只。將含有質粒的 500181。轉染后 5～ 6h，更換新鮮配制 的 MEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 48h， 熒光顯微鏡下觀察結果并照相保存 。計數(shù)時僅計數(shù)細胞核與胞漿完整