【導(dǎo)讀】形成自己的特色，達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。行性變性死亡相關(guān)的新假說(shuō)。的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估量表，綜合評(píng)價(jià)其作為PD臨床預(yù)警指標(biāo)的可能性。發(fā)表相關(guān)SCI收錄文章不少于120篇，其中IF?培養(yǎng)博士后25-30名，博士與碩士生300-320名。類iPS細(xì)胞移植治療PD的相關(guān)研究。全身性病理過(guò)程這一關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。從老化、遺傳和環(huán)境之間的相互關(guān)系在觸發(fā)PD起始中所起的作用（課。的實(shí)施，使我國(guó)在PD研究領(lǐng)域的工作總體上達(dá)到世界先進(jìn)水平。本項(xiàng)目在前期研究中發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)中國(guó)人PD獨(dú)特風(fēng)險(xiǎn)基因變異及環(huán)。境易感因素，但其參與發(fā)病的具體機(jī)制尚未闡明。進(jìn)展的影響，探討風(fēng)險(xiǎn)基因在PD早期預(yù)警和早期診斷中的作用。期診斷中的作用；為PD檢測(cè)技術(shù)方法的基礎(chǔ)；為何PD會(huì)發(fā)生這種區(qū)域性和神經(jīng)元種類。屬離子以及線粒體等代謝及功能障礙）是其選擇性變性死亡的基礎(chǔ)。究，將有助于揭示DA能神經(jīng)元選擇性變性死亡的機(jī)制。通過(guò)對(duì)PD相關(guān)蛋白的相互作用對(duì)線粒體損傷和保護(hù)作

　　

【正文】 d4 和 ER 轉(zhuǎn)錄因子等 相互作用 分析 組蛋白修飾 分析 靶基因表達(dá) 分析 建立腫瘤發(fā)生 發(fā)展 侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的組蛋白 修飾網(wǎng)絡(luò) 高通量芯片、酵母雙雜交、 免疫沉淀 質(zhì)譜 課題 負(fù)責(zé)人： 宋旭，四川大學(xué) 學(xué)術(shù)骨干： 宋爾衛(wèi)，中山 大學(xué) 李沁桐，四川大學(xué) 課題四：上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)換的機(jī)理及 惡性腫瘤 侵襲轉(zhuǎn)移的 細(xì)胞重編程機(jī)制 以乳腺癌細(xì)胞系、腫瘤組織及癌旁正常組織為模型，探討 EMT 的細(xì)胞重編程作用機(jī)理及其在乳腺癌轉(zhuǎn)移及化療藥物耐受中的作用。選取永生化的正常乳腺細(xì)胞系（如 MCF10A）， ER 陽(yáng)性低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系（如 MCF7， T47D 等）， ER 陰性高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系（如 MDAMB231， SUM1315 等），以及 ER 陽(yáng)性但對(duì)三苯氧胺耐藥的 BT474 細(xì)胞等為主要細(xì)胞模型，并通過(guò) lentivirus 介導(dǎo)的 shRNA 抑制或過(guò)表達(dá) Ecadherin 在 這些細(xì)胞系中分別誘導(dǎo)或抑制 EMT 表型。比較不同細(xì)胞系在 EMT前后其基因表達(dá)譜變化，用 MeDIPseq 法比較基因組范圍內(nèi) DNA 甲基化變化情況，并用 ChIPseq 法比較與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的主要的組蛋白修飾標(biāo)志如激活性的 組蛋白乙?；?、 H3K4 甲基化，抑制性的 H3K9， H3K27， H4K20 甲基化等在全基因組范圍內(nèi)的分布變化規(guī)律。在此基礎(chǔ)上，對(duì)差異表達(dá)的新基因及特異性組蛋白修飾酶在 EMT 以及在乳腺癌轉(zhuǎn)移及藥物耐受中的作用做深入分析。同時(shí)，選取兩種以上高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系，以 TGF?或 TNF?刺激細(xì)胞 或 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 ?catenin 分別激活TGF?、 NF?B 以及 Wnt 信號(hào)通路誘導(dǎo) EMT。用基因表達(dá)譜、蛋白質(zhì)譜及全蛋白磷酸化譜分析在三種條件下共同變化的靶基因及蛋白分子。這些共同通路分子是各信號(hào)通路間的交互作用節(jié)點(diǎn)及潛在的 EMT 關(guān)鍵調(diào)控因子，對(duì)它們的作用機(jī)理進(jìn)非 編碼 RNA 與腫 瘤發(fā)生發(fā)展研究 腫瘤相關(guān)蛋白結(jié)合的 ncRNA 的研究 闡明 ncRNA蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系 RNASELEXseq 技術(shù)平臺(tái)鑒定與腫瘤相關(guān)蛋白結(jié)合的 ncRNA Sizefractioned RNA library 鑒定腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞特異 ncRNA 探討 ncRNA蛋白相互作用及對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控 利用體外培養(yǎng)、免疫缺陷小鼠腫瘤移植、腫瘤病理組織檢測(cè)等進(jìn)行功能研究 行進(jìn)一步細(xì)胞及分子水平上的分析。建立可誘導(dǎo)表達(dá)熒光標(biāo)記的 Ecadherin 或其它 EMT 誘導(dǎo)因子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，以在細(xì)胞及分子水平上實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變對(duì) EMT 及細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。 總體研究方案如下： 課題 負(fù)責(zé)人： 尚永豐，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部 學(xué)術(shù)骨干： 梁靜，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部 張華， 中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心 課題五：細(xì)胞微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移 以乳腺癌為模型，分別從腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞（腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞）和基質(zhì)分子（細(xì)胞因子 TGFβ）入手，研究腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為尤其 是 侵襲轉(zhuǎn)移的影響。分離乳腺 良性增生患者及各種不同類型不同分期的乳腺癌 患者 組織微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞及腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞，分析 miRNA 及 mRNA 的表達(dá)譜；研究這些差異表 達(dá)的基因或 miRNA對(duì)成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響； 建立 三維細(xì)胞培養(yǎng) 模型 ，將腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，盡量模擬體內(nèi)環(huán)境，并應(yīng)用免疫分子及免疫細(xì)胞缺陷小鼠構(gòu)建小鼠骨髓嵌合體動(dòng)物模型，研究這些差異表達(dá)的基因或 miRNA 對(duì)共培養(yǎng)后腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響；采用基因工程小鼠模型， 從分子、細(xì)胞、動(dòng)物上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)換的機(jī)理 及表觀遺傳機(jī)制 建立低轉(zhuǎn)移性、高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系及人工改變 Ecadherin水平誘導(dǎo)或 抑制 EMT后的細(xì)胞系 尋找高轉(zhuǎn)移性乳腺癌及對(duì)現(xiàn)有化療藥物不敏感性的乳腺癌的治療靶點(diǎn) 基因表達(dá)譜差異 ChIPseq檢測(cè)主要轉(zhuǎn)錄相關(guān)組蛋白修飾 差異表達(dá)基因總體特征分析 新基因功能分析及特異性組蛋白修飾酶 在EMT中的作用 功能域分析； 質(zhì)譜檢測(cè)并驗(yàn)證相互作用蛋白；靶基因檢測(cè)；與已知 EMT基因關(guān)系 病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)及 shRNA抑制候選基因后，細(xì)胞表型及小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移模型的行為變化 MeDIPseq檢測(cè) DNA甲基化變化 以 TGF?或 TNF?刺激細(xì)胞 或 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染?catenin分別誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生 EMT 蛋白質(zhì)譜差異 磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)差異 三個(gè)層面研究 TGFβ 信號(hào)通路在腫瘤微環(huán)境中與 REG?蛋白酶體激活因子、 p53 等重要腫瘤因子動(dòng)態(tài)相互作用 及其動(dòng)態(tài)調(diào)控的分子機(jī)制。在解析這些調(diào)控機(jī)制的生理病理意義的基礎(chǔ)上，通過(guò)腫瘤模型研究進(jìn)一步 闡 明 腫瘤微環(huán)境中重要 生物學(xué)因子對(duì) 腫瘤發(fā)生發(fā)展的決定性作用 。 具體方案如下： 課題 負(fù)責(zé)人： 劉芝華，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所 學(xué)術(shù)骨干： 李曉濤，華東師范大學(xué)生命科學(xué)研究所 曲春楓，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所 課題六：惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 利用腫瘤基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，采用計(jì)算生物學(xué)方法推測(cè)在惡性腫瘤、干細(xì)胞中發(fā)生變化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為了更深入地研究腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還需要從以下幾個(gè)方面進(jìn)一步發(fā)展基于貝葉斯網(wǎng)絡(luò)的因果推斷方法。 （ 1） 考慮到實(shí)驗(yàn)方法與手段的多樣性，需要開(kāi)發(fā)能夠自動(dòng)整合 并利用多個(gè)異質(zhì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的因果推斷方法。這部分工作涉及去除反映單個(gè)數(shù)據(jù)源自身特征的背景信號(hào)，子網(wǎng)絡(luò)的拼接與集成，觀測(cè)型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與 (基因敲除、 RNA 沉默等 )干預(yù)型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的因果信息集成等多個(gè)問(wèn)題 ；（ 2） 通過(guò)開(kāi)發(fā)根據(jù)數(shù)據(jù)特征自適應(yīng)地調(diào)整網(wǎng)絡(luò)正則化參數(shù)的學(xué)習(xí)算法等方式，以解決如何在具有較高噪聲和不精確性的系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中進(jìn)行可靠因果推斷的實(shí)際問(wèn)題。對(duì)于大規(guī)模因果mRNA及 miRNA表達(dá)譜分析 正常乳腺組織及不同類型的乳腺癌組織 建立基質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型 明確基質(zhì)細(xì)胞的基因 /miRNA對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng) TGFβ 信號(hào)通路 /REG?蛋白酶體 動(dòng)物水平 Smad2 亞等位基因表達(dá)小鼠模型 闡明 REG?蛋白酶體與 TGFβ 信號(hào)通路間的相互作用 細(xì)胞微環(huán)境與腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移 基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作 用 分子、細(xì)胞水平 基因 /miRNA的功能研究 基因敲除 建立腫瘤與細(xì)胞微環(huán)境網(wǎng)絡(luò)體系 腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞 免疫缺陷 小鼠骨髓嵌合體動(dòng)物模型構(gòu)建 推斷問(wèn)題，使用現(xiàn)有的貝葉斯因果推斷方法，還面臨有限的數(shù)據(jù)資源與急劇增大的網(wǎng)絡(luò)搜索空間的矛盾。為了保證學(xué)習(xí)結(jié)果的魯棒性，我們擬開(kāi)發(fā)一系列能保持因果關(guān)系的特 征選擇方法來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。 （ 3） 不同系統(tǒng)生物學(xué)因素之間的上下游作用關(guān)系可能會(huì)隨腫瘤發(fā)生與發(fā)展的過(guò)程而動(dòng)態(tài)地發(fā)生變化，為此我們擬開(kāi)發(fā)能夠正確推斷這種動(dòng)態(tài)關(guān)系的貝葉斯網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)算法。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞有很多具有干細(xì)胞特性，且目前所掌握的胚胎干細(xì)胞數(shù)據(jù)比腫瘤數(shù)據(jù)更豐富也更系統(tǒng) ,我們將在惡性腫瘤與干細(xì)胞中分別預(yù)測(cè)基因表達(dá)與表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò) ， 并進(jìn)一步比較其異同。通過(guò)干擾預(yù)測(cè)的上游調(diào)控節(jié)點(diǎn)后以 ChIPPCR 和 ChIPseq 技術(shù)對(duì)下游節(jié)點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)以上預(yù)測(cè)模型中的關(guān)鍵調(diào)控關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。為了通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型推測(cè)出來(lái)的因 果關(guān)系，我們將把它們作為遺傳學(xué)的上下游關(guān)系處理。這樣 就可以人為 地 提高或降低上游事件的水平，例如，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或者其他組蛋白修飾水平，而后觀察下游事件，如基因表達(dá)，或者組蛋白或 DNA 修飾的水平的變化，來(lái)證實(shí)我們所預(yù)測(cè)的因果關(guān)系。以組蛋白甲基化修飾作用為例，甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶是可用于干擾網(wǎng)絡(luò)中的特定節(jié)點(diǎn)。譬如我們要證實(shí)H3K27me3 抑制基因表達(dá)這一關(guān)系，我們可以通過(guò)抑制正常細(xì)胞或者癌細(xì)胞的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶或者去甲基化酶來(lái)調(diào)節(jié) H3K27me3 水平，從而觀察下游基因表達(dá)水平的變化（圖 2）。實(shí)際上，一些已報(bào) 道的因果關(guān)系正是利用上述方法和遺傳突變?cè)谀Ｊ缴锘蚣?xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的。驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子對(duì)某種組蛋白修飾的作用可以通過(guò)過(guò)表達(dá)或者 RNAi 轉(zhuǎn)錄因子來(lái)直接觀察到。我們將通過(guò)過(guò)表達(dá)或者 RNAi 分別上調(diào)或者下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子，然后利用 ChIPqPCR 技術(shù)檢測(cè)一些已知的修飾位點(diǎn)或者利用 ChIPseq 技術(shù)在全基因水平檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)全基因組范圍內(nèi)組蛋白修飾的影響。 圖 2： 如何通過(guò)干擾上游調(diào)控節(jié)點(diǎn)并以 ChIPPCR 和 ChIPseq 技術(shù) 檢測(cè)下游基因驗(yàn)證預(yù)測(cè)模型中的關(guān)鍵調(diào)控關(guān)系 具體方案 如下： 課題 負(fù)責(zé)人：韓敬東，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 學(xué)術(shù)骨干： 吳 旻 ，武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 染色質(zhì)與組蛋白的多種表觀遺傳學(xué)修飾 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與基因的調(diào)控關(guān)系 轉(zhuǎn)錄因子的 ChIPseq實(shí)驗(yàn) 基因表達(dá)譜差異分析 染色質(zhì)構(gòu)型分析 表觀遺傳因子 ChIPseq實(shí)驗(yàn) 絕緣子的基因組分布 表觀遺傳因子的基因組分布 轉(zhuǎn)錄因子的目標(biāo)基因分布 染色質(zhì)空間形態(tài)與 DNA、組蛋白修飾的因果調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)基因的 調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 多 因 素 SNP 與GWAS分析：鑒定腫瘤發(fā)病相關(guān)的重要基因突變相互關(guān)系 惡性腫瘤發(fā)病因素預(yù)測(cè)的因果網(wǎng)絡(luò)模型 RNAi 與基因 敲除研究：驗(yàn)證腫瘤發(fā)病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與基因的影響范圍 惡性腫瘤高通量數(shù)據(jù)的整合與網(wǎng)絡(luò)的計(jì)算預(yù)測(cè) 四、年度計(jì)劃 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1） 多種手段研究肺癌細(xì)胞腫瘤抑制基因甲基化狀況，開(kāi)展腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān) DNA 甲基化標(biāo)志物研究；開(kāi)展 PcG 蛋白表達(dá)變異與腫瘤抑制基因表觀遺傳失活關(guān)系研究； 2） 利用高通量芯片、 ChIPChip、ChIPseq、酵母雙雜交、免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜等技術(shù)，針對(duì) TGFβ和雌激素信號(hào)通路相關(guān)因子，如轉(zhuǎn)錄因子 Smad ER 及其轉(zhuǎn)錄輔助因子，篩選新的組 蛋白修飾基因或 miRNA； 3） 利用 RNASELEXseq 等技術(shù)平臺(tái)系統(tǒng)篩選鑒定與腫瘤相關(guān)蛋白相互作用的 ncRNA；檢測(cè) ncRNA 的表達(dá)譜； 4） 誘導(dǎo)或抑制 EMT 表型。比較不同細(xì)胞系在 EMT 前后其基因表達(dá)譜變化， 用 MeDIPseq 法比較基因組范圍內(nèi) DNA 甲基化變化情況，并用 ChIPseq 法比較與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的主要的組蛋白修飾標(biāo)志如激活性的組蛋白乙?；?H3K4 甲基化，抑制性的 H3K9， H3K27， H4K20甲基化等在全基因組范圍內(nèi)的分布變化規(guī)律。 5） 分離乳腺良性增生患者及乳腺癌患者 微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞 、 浸潤(rùn)巨噬 細(xì)胞 、 浸潤(rùn)的單核巨噬細(xì)胞 ，分析 miRNA及 mRNA的表達(dá)譜，研究不同類型的乳腺癌以及不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌中上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)譜差異 ； 6） 開(kāi)發(fā)能夠自動(dòng)整合并利用多個(gè)異質(zhì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的因果推斷方法。 包括 去除反映單個(gè)數(shù)據(jù)源自身特征的背景信號(hào)，子網(wǎng)絡(luò)的拼接與集成，觀測(cè)型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與 (基因敲1） 找出有代表性的腫瘤抑制基因，分析甲基化譜，篩選出一組腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān) DNA 甲基化標(biāo)志物；掌握腫瘤組織中多種 PcG 蛋白表達(dá)變異規(guī)律； 2） 獲得新的組蛋白修飾組分； 3） 篩選出一批腫瘤 相關(guān)的 ncRNA；并確定 ncRNA 及相關(guān)蛋白的表達(dá)譜； 4） 優(yōu)化 EMT 表型誘導(dǎo)條件，完成基因表達(dá)譜及 MeDIPseq，ChIPseq法比較 DNA甲基化及主要組蛋白修飾譜變化實(shí)驗(yàn) ； 5） 發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的不同 間質(zhì)細(xì)胞的表型特征，以及一些重要的免疫相關(guān)蛋白、間質(zhì)細(xì)胞中 miRNA及 mRNA的表達(dá)改變； 6） 建立 能夠自動(dòng)整合并利用多個(gè)異質(zhì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) ，適用于大規(guī)模高噪聲的組學(xué)數(shù)據(jù) 的因果推斷方法 ，并開(kāi)發(fā)為計(jì)算軟件 。 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 除、 RNA 沉默等 )干預(yù)型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的因果信息集成等多個(gè)問(wèn)題。 第 二 年 1） 分析圍繞甲基化基因啟動(dòng)子周?chē)慕M蛋白修飾狀況，開(kāi)展核小體在 DNA 甲基化擴(kuò)展過(guò)程中的 作用研究；開(kāi)展腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)甲基化標(biāo)志物多中心驗(yàn)證研究； 2） 利用免疫共沉淀、 GST pulldown、細(xì)胞內(nèi)共定位等蛋白質(zhì)間相互作用技術(shù)驗(yàn)證篩選