【導讀】形成自己的特色，達到國際先進水平。行性變性死亡相關的新假說。的風險評估量表，綜合評價其作為PD臨床預警指標的可能性。發(fā)表相關SCI收錄文章不少于120篇，其中IF?培養(yǎng)博士后25-30名，博士與碩士生300-320名。類iPS細胞移植治療PD的相關研究。全身性病理過程這一關鍵科學問題。從老化、遺傳和環(huán)境之間的相互關系在觸發(fā)PD起始中所起的作用（課。的實施，使我國在PD研究領域的工作總體上達到世界先進水平。本項目在前期研究中發(fā)現(xiàn)了數(shù)個中國人PD獨特風險基因變異及環(huán)。境易感因素，但其參與發(fā)病的具體機制尚未闡明。進展的影響，探討風險基因在PD早期預警和早期診斷中的作用。期診斷中的作用；為PD檢測技術方法的基礎；為何PD會發(fā)生這種區(qū)域性和神經(jīng)元種類。屬離子以及線粒體等代謝及功能障礙）是其選擇性變性死亡的基礎。究，將有助于揭示DA能神經(jīng)元選擇性變性死亡的機制。通過對PD相關蛋白的相互作用對線粒體損傷和保護作

　　

【正文】 d4 和 ER 轉錄因子等 相互作用 分析 組蛋白修飾 分析 靶基因表達 分析 建立腫瘤發(fā)生 發(fā)展 侵襲轉移相關的組蛋白 修飾網(wǎng)絡 高通量芯片、酵母雙雜交、 免疫沉淀 質譜 課題 負責人： 宋旭，四川大學 學術骨干： 宋爾衛(wèi)，中山 大學 李沁桐，四川大學 課題四：上皮－間質轉換的機理及 惡性腫瘤 侵襲轉移的 細胞重編程機制 以乳腺癌細胞系、腫瘤組織及癌旁正常組織為模型，探討 EMT 的細胞重編程作用機理及其在乳腺癌轉移及化療藥物耐受中的作用。選取永生化的正常乳腺細胞系（如 MCF10A）， ER 陽性低轉移性細胞系（如 MCF7， T47D 等）， ER 陰性高轉移細胞系（如 MDAMB231， SUM1315 等），以及 ER 陽性但對三苯氧胺耐藥的 BT474 細胞等為主要細胞模型，并通過 lentivirus 介導的 shRNA 抑制或過表達 Ecadherin 在 這些細胞系中分別誘導或抑制 EMT 表型。比較不同細胞系在 EMT前后其基因表達譜變化，用 MeDIPseq 法比較基因組范圍內 DNA 甲基化變化情況，并用 ChIPseq 法比較與轉錄相關的主要的組蛋白修飾標志如激活性的 組蛋白乙?；?、 H3K4 甲基化，抑制性的 H3K9， H3K27， H4K20 甲基化等在全基因組范圍內的分布變化規(guī)律。在此基礎上，對差異表達的新基因及特異性組蛋白修飾酶在 EMT 以及在乳腺癌轉移及藥物耐受中的作用做深入分析。同時，選取兩種以上高轉移性細胞系，以 TGF?或 TNF?刺激細胞 或 穩(wěn)定轉染 ?catenin 分別激活TGF?、 NF?B 以及 Wnt 信號通路誘導 EMT。用基因表達譜、蛋白質譜及全蛋白磷酸化譜分析在三種條件下共同變化的靶基因及蛋白分子。這些共同通路分子是各信號通路間的交互作用節(jié)點及潛在的 EMT 關鍵調控因子，對它們的作用機理進非 編碼 RNA 與腫 瘤發(fā)生發(fā)展研究 腫瘤相關蛋白結合的 ncRNA 的研究 闡明 ncRNA蛋白調控網(wǎng)絡與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系 RNASELEXseq 技術平臺鑒定與腫瘤相關蛋白結合的 ncRNA Sizefractioned RNA library 鑒定腫瘤啟動細胞特異 ncRNA 探討 ncRNA蛋白相互作用及對相關信號通路的調控 利用體外培養(yǎng)、免疫缺陷小鼠腫瘤移植、腫瘤病理組織檢測等進行功能研究 行進一步細胞及分子水平上的分析。建立可誘導表達熒光標記的 Ecadherin 或其它 EMT 誘導因子的穩(wěn)定轉染細胞系，以在細胞及分子水平上實時觀察細胞內外環(huán)境的改變對 EMT 及細胞轉移能力的影響。 總體研究方案如下： 課題 負責人： 尚永豐，北京大學醫(yī)學部 學術骨干： 梁靜，北京大學醫(yī)學部 張華， 中國航天員科研訓練中心 課題五：細胞微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移 以乳腺癌為模型，分別從腫瘤細胞微環(huán)境中的腫瘤相關成纖維細胞、浸潤的免疫細胞（腫瘤相關性巨噬細胞）和基質分子（細胞因子 TGFβ）入手，研究腫瘤微環(huán)境對腫瘤細胞生物學行為尤其 是 侵襲轉移的影響。分離乳腺 良性增生患者及各種不同類型不同分期的乳腺癌 患者 組織微環(huán)境中的成纖維細胞及腫瘤相關性巨噬細胞，分析 miRNA 及 mRNA 的表達譜；研究這些差異表 達的基因或 miRNA對成纖維細胞及腫瘤細胞侵襲轉移能力的影響； 建立 三維細胞培養(yǎng) 模型 ，將腫瘤細胞與基質細胞共培養(yǎng)，盡量模擬體內環(huán)境，并應用免疫分子及免疫細胞缺陷小鼠構建小鼠骨髓嵌合體動物模型，研究這些差異表達的基因或 miRNA 對共培養(yǎng)后腫瘤細胞侵襲轉移能力的影響；采用基因工程小鼠模型， 從分子、細胞、動物上皮－間質轉換的機理 及表觀遺傳機制 建立低轉移性、高轉移性乳腺癌細胞系及人工改變 Ecadherin水平誘導或 抑制 EMT后的細胞系 尋找高轉移性乳腺癌及對現(xiàn)有化療藥物不敏感性的乳腺癌的治療靶點 基因表達譜差異 ChIPseq檢測主要轉錄相關組蛋白修飾 差異表達基因總體特征分析 新基因功能分析及特異性組蛋白修飾酶 在EMT中的作用 功能域分析； 質譜檢測并驗證相互作用蛋白；靶基因檢測；與已知 EMT基因關系 病毒介導的穩(wěn)定過表達及 shRNA抑制候選基因后，細胞表型及小鼠乳腺癌轉移模型的行為變化 MeDIPseq檢測 DNA甲基化變化 以 TGF?或 TNF?刺激細胞 或 穩(wěn)定轉染?catenin分別誘導癌細胞發(fā)生 EMT 蛋白質譜差異 磷酸化修飾蛋白質組學差異 三個層面研究 TGFβ 信號通路在腫瘤微環(huán)境中與 REG?蛋白酶體激活因子、 p53 等重要腫瘤因子動態(tài)相互作用 及其動態(tài)調控的分子機制。在解析這些調控機制的生理病理意義的基礎上，通過腫瘤模型研究進一步 闡 明 腫瘤微環(huán)境中重要 生物學因子對 腫瘤發(fā)生發(fā)展的決定性作用 。 具體方案如下： 課題 負責人： 劉芝華，中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所 學術骨干： 李曉濤，華東師范大學生命科學研究所 曲春楓，中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所 課題六：惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移的分子調控網(wǎng)絡 利用腫瘤基因表達和表觀遺傳學數(shù)據(jù)，采用計算生物學方法推測在惡性腫瘤、干細胞中發(fā)生變化的表觀遺傳學調控網(wǎng)絡。為了更深入地研究腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的分子調控網(wǎng)絡，還需要從以下幾個方面進一步發(fā)展基于貝葉斯網(wǎng)絡的因果推斷方法。 （ 1） 考慮到實驗方法與手段的多樣性，需要開發(fā)能夠自動整合 并利用多個異質實驗數(shù)據(jù)的因果推斷方法。這部分工作涉及去除反映單個數(shù)據(jù)源自身特征的背景信號，子網(wǎng)絡的拼接與集成，觀測型實驗數(shù)據(jù)與 (基因敲除、 RNA 沉默等 )干預型實驗數(shù)據(jù)的因果信息集成等多個問題 ；（ 2） 通過開發(fā)根據(jù)數(shù)據(jù)特征自適應地調整網(wǎng)絡正則化參數(shù)的學習算法等方式，以解決如何在具有較高噪聲和不精確性的系統(tǒng)生物學實驗數(shù)據(jù)中進行可靠因果推斷的實際問題。對于大規(guī)模因果mRNA及 miRNA表達譜分析 正常乳腺組織及不同類型的乳腺癌組織 建立基質細胞與腫瘤細胞的三維細胞培養(yǎng)模型 明確基質細胞的基因 /miRNA對腫瘤轉移的影響 腫瘤相關成纖維細胞原代培養(yǎng) TGFβ 信號通路 /REG?蛋白酶體 動物水平 Smad2 亞等位基因表達小鼠模型 闡明 REG?蛋白酶體與 TGFβ 信號通路間的相互作用 細胞微環(huán)境與腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移 基質細胞、細胞因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作 用 分子、細胞水平 基因 /miRNA的功能研究 基因敲除 建立腫瘤與細胞微環(huán)境網(wǎng)絡體系 腫瘤相關性巨噬細胞 免疫缺陷 小鼠骨髓嵌合體動物模型構建 推斷問題，使用現(xiàn)有的貝葉斯因果推斷方法，還面臨有限的數(shù)據(jù)資源與急劇增大的網(wǎng)絡搜索空間的矛盾。為了保證學習結果的魯棒性，我們擬開發(fā)一系列能保持因果關系的特 征選擇方法來解決這個問題。 （ 3） 不同系統(tǒng)生物學因素之間的上下游作用關系可能會隨腫瘤發(fā)生與發(fā)展的過程而動態(tài)地發(fā)生變化，為此我們擬開發(fā)能夠正確推斷這種動態(tài)關系的貝葉斯網(wǎng)絡學習算法。因為腫瘤細胞有很多具有干細胞特性，且目前所掌握的胚胎干細胞數(shù)據(jù)比腫瘤數(shù)據(jù)更豐富也更系統(tǒng) ,我們將在惡性腫瘤與干細胞中分別預測基因表達與表觀調控網(wǎng)絡 ， 并進一步比較其異同。通過干擾預測的上游調控節(jié)點后以 ChIPPCR 和 ChIPseq 技術對下游節(jié)點進行檢測，對以上預測模型中的關鍵調控關系進行驗證。為了通過實驗驗證貝葉斯網(wǎng)絡模型推測出來的因 果關系，我們將把它們作為遺傳學的上下游關系處理。這樣 就可以人為 地 提高或降低上游事件的水平，例如，轉錄因子結合或者其他組蛋白修飾水平，而后觀察下游事件，如基因表達，或者組蛋白或 DNA 修飾的水平的變化，來證實我們所預測的因果關系。以組蛋白甲基化修飾作用為例，甲基化轉移酶和去甲基化酶是可用于干擾網(wǎng)絡中的特定節(jié)點。譬如我們要證實H3K27me3 抑制基因表達這一關系，我們可以通過抑制正常細胞或者癌細胞的組蛋白甲基化轉移酶或者去甲基化酶來調節(jié) H3K27me3 水平，從而觀察下游基因表達水平的變化（圖 2）。實際上，一些已報 道的因果關系正是利用上述方法和遺傳突變在模式生物或細胞實驗中發(fā)現(xiàn)的。驗證轉錄因子對某種組蛋白修飾的作用可以通過過表達或者 RNAi 轉錄因子來直接觀察到。我們將通過過表達或者 RNAi 分別上調或者下調轉錄因子，然后利用 ChIPqPCR 技術檢測一些已知的修飾位點或者利用 ChIPseq 技術在全基因水平檢測轉錄因子對全基因組范圍內組蛋白修飾的影響。 圖 2： 如何通過干擾上游調控節(jié)點并以 ChIPPCR 和 ChIPseq 技術 檢測下游基因驗證預測模型中的關鍵調控關系 具體方案 如下： 課題 負責人：韓敬東，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所 學術骨干： 吳 旻 ，武漢大學生命科學學院 染色質與組蛋白的多種表觀遺傳學修飾 關鍵轉錄因子與基因的調控關系 轉錄因子的 ChIPseq實驗 基因表達譜差異分析 染色質構型分析 表觀遺傳因子 ChIPseq實驗 絕緣子的基因組分布 表觀遺傳因子的基因組分布 轉錄因子的目標基因分布 染色質空間形態(tài)與 DNA、組蛋白修飾的因果調控網(wǎng)絡 關鍵轉錄因子與目標基因的 調控網(wǎng)絡 多 因 素 SNP 與GWAS分析：鑒定腫瘤發(fā)病相關的重要基因突變相互關系 惡性腫瘤發(fā)病因素預測的因果網(wǎng)絡模型 RNAi 與基因 敲除研究：驗證腫瘤發(fā)病相關轉錄因子與基因的影響范圍 惡性腫瘤高通量數(shù)據(jù)的整合與網(wǎng)絡的計算預測 四、年度計劃 研究內容 預期目標 第 一 年 1） 多種手段研究肺癌細胞腫瘤抑制基因甲基化狀況，開展腫瘤轉移相關 DNA 甲基化標志物研究；開展 PcG 蛋白表達變異與腫瘤抑制基因表觀遺傳失活關系研究； 2） 利用高通量芯片、 ChIPChip、ChIPseq、酵母雙雜交、免疫沉淀結合質譜等技術，針對 TGFβ和雌激素信號通路相關因子，如轉錄因子 Smad ER 及其轉錄輔助因子，篩選新的組 蛋白修飾基因或 miRNA； 3） 利用 RNASELEXseq 等技術平臺系統(tǒng)篩選鑒定與腫瘤相關蛋白相互作用的 ncRNA；檢測 ncRNA 的表達譜； 4） 誘導或抑制 EMT 表型。比較不同細胞系在 EMT 前后其基因表達譜變化， 用 MeDIPseq 法比較基因組范圍內 DNA 甲基化變化情況，并用 ChIPseq 法比較與轉錄相關的主要的組蛋白修飾標志如激活性的組蛋白乙?；?H3K4 甲基化，抑制性的 H3K9， H3K27， H4K20甲基化等在全基因組范圍內的分布變化規(guī)律。 5） 分離乳腺良性增生患者及乳腺癌患者 微環(huán)境中的成纖維細胞 、 浸潤巨噬 細胞 、 浸潤的單核巨噬細胞 ，分析 miRNA及 mRNA的表達譜，研究不同類型的乳腺癌以及不同侵襲轉移能力的乳腺癌中上皮細胞與間質細胞的表達譜差異 ； 6） 開發(fā)能夠自動整合并利用多個異質實驗數(shù)據(jù)的因果推斷方法。 包括 去除反映單個數(shù)據(jù)源自身特征的背景信號，子網(wǎng)絡的拼接與集成，觀測型實驗數(shù)據(jù)與 (基因敲1） 找出有代表性的腫瘤抑制基因，分析甲基化譜，篩選出一組腫瘤轉移相關 DNA 甲基化標志物；掌握腫瘤組織中多種 PcG 蛋白表達變異規(guī)律； 2） 獲得新的組蛋白修飾組分； 3） 篩選出一批腫瘤 相關的 ncRNA；并確定 ncRNA 及相關蛋白的表達譜； 4） 優(yōu)化 EMT 表型誘導條件，完成基因表達譜及 MeDIPseq，ChIPseq法比較 DNA甲基化及主要組蛋白修飾譜變化實驗 ； 5） 發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉移相關的不同 間質細胞的表型特征，以及一些重要的免疫相關蛋白、間質細胞中 miRNA及 mRNA的表達改變； 6） 建立 能夠自動整合并利用多個異質實驗數(shù)據(jù) ，適用于大規(guī)模高噪聲的組學數(shù)據(jù) 的因果推斷方法 ，并開發(fā)為計算軟件 。 研究內容 預期目標 除、 RNA 沉默等 )干預型實驗數(shù)據(jù)的因果信息集成等多個問題。 第 二 年 1） 分析圍繞甲基化基因啟動子周圍的組蛋白修飾狀況，開展核小體在 DNA 甲基化擴展過程中的 作用研究；開展腫瘤轉移相關甲基化標志物多中心驗證研究； 2） 利用免疫共沉淀、 GST pulldown、細胞內共定位等蛋白質間相互作用技術驗證篩選